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UN ESTUDIO FISIOLÓGICO, ANATÓMICO,
MORFOLÓGICO Y MOLECULAR DE LA RESPUESTA DE

LOTUS TENUIS AL ESTRÉS SALINO ALCALINO.

ROSALÍA CRISTINA PAZ
Trabajo de tesis para ser presentado como requisito parcial para optar al
Grado de Doctora

Director: Oscar A. Ruiz
Co-Director: Fernando L. Pieckenstain

Buenos Aires, Argentina
2011

IIB-INTECH

Instituto de Investigaciones
Biotecnológicas – Instituto
Tecnológico de Chascomús

FFyB - UBA

Consejo Nacional de
Investigaciones Científicas y
Técnicas

Facultad de Farmacia y
Bioquímica – Universidad
i.
Autónoma de Buenos Aires.

ii

Un estudio fisiológico, anatómico, morfológico y
molecular de la respuesta de Lotus spp. al estrés salino
alcalino.

ROSALÍA CRISTINA PAZ

Comité Consejero:

------------------------------------------------------Dr. Oscar A. Ruiz
Director de Tesis

------------------------------------------------------Dr. Fernando L. Pieckenstain
Co-Director de Tesis

------------------------------------------------------Dr. Alberto A. Gurni
Consejero de Estudios

iii

DEDICATORIA

Dedico esta tesis a mis padres, Ruth y Jorge, y a mis hermanos Paula y Luis.
Gracias por apoyarme y por estar a mi lado siempre

También quiero dedicárselo a dos personas que me hicieron volver a creer que
es posible cambiar las realidades.
Gracias, Cristina y Néstor!

iv

AGRADECIMIENTOS

Es difícil poder resumir tantos años y tantas experiencias en dos páginas. El cierre de esta
etapa de mi vida viene de la mano con cerrar un ciclo de 8 años de trabajo en el INTECH. En
este sentido, mi primer agradecimiento está dirigido al Instituto. Fue en esos pasillos que
empecé a dar mis primeros pasos en la investigación.
Siguiendo este orden de jerarquía, quiero agradecer a mis compañeros de laboratorio por todo
el apoyo y afecto que han tenido para conmigo en todos estos años. Es un laboratorio
numeroso por donde pasaron muchas personas, pero quiero agradecerle a María, a Matías, a
Franco, a Santiago (Prolino), a Elisa, a Nazareno, a Mariela, a Andrés, a Analía, a Andrea y a
Paula. Han sido todos muy buenos compañeros y amigos.
También quiero agradecer al AGENCIA y al CONICET por haberme brindado la posibilidad de
acceder a becas de estudio para poder realizar mis estudios de posgrado. De la misma
manera, quiero agradecer a las políticas desarrolladas en Ciencia y Técnica, sin las cuales,
considero que hubiera sido muy difícil que siguiera mi carrera científica en Argentina.
En lo referente al Capítulo II de este trabajo, debo agradecer particularmente a la Dra. Ana
Menéndez. Gracias por orientarme a interpretar el lenguaje de las raíces
En el Capítulo III, toda la parte de anatomía solo fue posible gracias al invalorable aporte de la
Dra. Herminda Reinoso, de la Universidad Nacional de Rio Cuarto. Me tuviste mucha paciencia,
Her. Gracias a vos le conocí hasta los estomas al Lotus!!! Muchas gracias!!
En lo referente a Herminda, quiero agradecerle a mi amiga, Mariana Reginato por facilitarme el
contacto, y orientarme para conseguir realizar esta pasantía. En especial, gracias por abrirme
las puertas de tu casa y tu familia (Flor y Marcos).
En ese mismo capítulo, debo agradecer también al Dr. Pedro Sansberro y a Fabiana
Espasadin, del IBONE (Corrientes). Ahí realicé todas las mediciones fisiológicas, y disfruté
enormemente de mi querido rio Paraná y el calor!!
Y el Capítulo IV, ah, México, mi querido México. Un viaje a mi infancia. Fue en esa tierra
maravillosa que se construyó la que denomino “la genoteca azteca”. Quiero agradecer al Dr.
Juan Francisco Jimenez Bremont y a Margarita Rodriguez-Kessler (la especialista en HSS).
Gracias por su tiempo y dedicación. También quiero agradecer a todos los compañeros que
tuve en su laboratorio, en especial a Alicia (quien me alojó en los primeros días de mi estancia
en San Luis Potosí), Aída (que me secuestró un par de veces del laboratorio para ir de chelas),
Erika, Azucena, Pablo y Luz. Aprovecho para extender mi agradecimiento al IPICYT (Instituto
Potosino de Investigaciones Científicas y Técnicas). Han sido muy cálidos conmigo.

v

Y como en el camino uno va conociendo gente nueva, quiero agradecerle profundamente a la
familia Rubin de Celis Leal, quienes me alojaron durante mi estancia en México y me recibieron
como una hija y hermana. Gracias a Odelmira, Carla, Tere y Rodrigo, Nydia y Paco, y en
especial, a Liset y a David. Muchas gracias, nunca los olvidaré!
Con respecto al Capítulo V de simbiosis, quiero agradecerle profundamente a la Dra. Julia
Estrella (quien es mi gurú en rizobiología). También debo agradecerle a Patricia, a Verónica y a
Nazareno, por toda la ayuda que me dieron durante los ensayos de simbiosis.
Debo hacer un agradecimiento muy especial a quien fue mi tesista, el flamante Lic. en Genética
Rubén A. Rocco. Gracias por tu calma, por tu compromiso y por ser la persona que eres!! Sin
vos, todo hubiera sido más difícil. Creo que hicimos un muy buen equipo!!
( Y hay un grupo que no tiene nada que ver directamente con esta tesis, pero que fue un
cable a tierra muy importante. Quiero abrir paréntesis para agradecer a mi ONG ambiental
Econciencia. Aprendí mucho con mis amigos econcientes! Gracias especiales a Raúl, Nancy,
Leo, el Cholo, Inesita y Germán. Gracias por las charlas, y por ponerle las pilas que le ponen a
la conservación del ambiente, nuestra revista Siglo XXI, y el trabajo con los colegios. Gracias
Raúl, por empujarme y encorajarme siempre!!!
También dentro de ese paréntesis, quiero agradecer a mis amigos fundadores del
Departamento de Prensa y Difusión del INTECH, a Jorge y Hugo, y a las posteriormente
incorporadas Esther e Inés. Creo que la divulgación debe formar parte del quehacer científico.
Hay que reducir las distancias entre ciencia y sociedad ).
Otro agradecimiento muy especial a mis amigos de siempre, que han estado en las buenas y
en las no tan buenas. Algunos ya los he mencionado anteriormente, pero quiero agregar a
Marina y Hernán, Flor, Lety, Alet y Diana. No quiero olvidarme de Matilde y Belisario.
También debo agradecerle a Perineta, por la buena suerte
Finalmente, quiero agradecer a mis directores. A Fernando, gracias por las sugerencias y
comentarios. Cuanto a Oscar, quiero que sepas que estoy muy agradecida por todas las
puertas que me has abierto. A pesar de nuestras diferencias, he aprendido mucho de vos, y en
parte, has ayudado a construir lo que hoy soy. Gracias

vi

INDICE

PORTADA
DEDICATO
DEDICATORIA
AGRADECIMIENTOS

I
IV
V

ÍNDICE

VI

ÍNDICE DE FIGURAS

XI

ÍNDICE DE TABLAS
RESUMEN
ABREVIATURAS

XIII
XIII
XV
XVII

CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL

1.

La salinidad como factor abiótico limitante para la productividad vegetal.

2.

Salinidad de los suelos

2.

Respuesta de las plantas al estrés

6.

Tipos de estrés salino y sus consecuencias para el desarrollo de las plantas

7.

A) Estrés salino

8.

B) Estrés alcalino

10.

C) Estrés mixto salino-alcalino

12.

La Pampa Deprimida

13.

Las leguminosas mejoran el valor forrajero de los pastizales

15.

Lotus tenuis y su potencialidad como forrajera en suelos de la Pampa Deprimida

16.

OBJETIVOS

18.

HIPÓTESIS

19.

CAPÍTULO II: HOMEOSTASIS
HOMEOSTASIS IÓNICA Y ARQUITECTURA
ARQUITECTURA DEL SISTEMA RADICAL

20.

INTRODUCCIÓN

21.

Homeostasis iónica

21.

Arquitectura del sistema radical

26.

vii

Arquitectura radical

27.

Modelado topológico

28.

RESULTADOS

31.

2.1. Parámetros de crecimiento

31.

2.1.1. Determinación de concentraciones óptimas para ensayos de alcalinidad en L. tenuis

31.

2.1.2. Biomasa y alopatía.

33.

2.2. Homeostasis iónica

35.
+

+

2.2.1. Contenido de los cationes Na y K .
+

2.2.2. Relación Na /K

+

35.
35.

2.2.3. Contenido del anión Cl-

37.

2.2.4. Nutrientes.

37.

2.2.5. La prolina como indicador de estrés osmótico.

38.

2.3. Arquitectura radical

39.

2.3.1. Longitudes radicales y parámetros de ramificación.

39.

2.3.2. Parámetros topológicos

43.

DISCUSIÓN

47.

CONCLUSIONES

57.

CAPÍTULO III: ANATOMÍA
ANATOMÍA Y FISIOLOGÍA

58.

INTRODUCCIÓN

59.

Plasticidad fenotípica y adaptación

59.

Adaptaciones de las plantas a ambientes salinos

61.

Lotus tenuis como especie plástica

65.

RESULTADOS

67.

3.1. ANATOMÍA DEL VÁSTAGO

67.

3.1.1. Hojas

67.

3.1.1.1. Área foliar.

67.

3.1.1.2. Características anatómicas – cortes transversales

68.

3.1.1.2. Características anatómicas – epidermis.

69.

3.1.2. Contenido de pigmentos fotosintéticos: clorofilas y carotenoides

73.

viii

3.1.3. Fotosíntesis, conductancia estomática y eficiencia en el uso del agua.

74.

3.2.1. Tallo con crecimiento primario

75.

3.2.2. Tallo con crecimiento secundario.

80.

3.2. ANATOMÍA RADICAL

83.

3.1.1. Raíz con crecimiento primario

83.

3.1.1. Raíz con crecimiento secundario

85.

DISCUSIÓN

88.

CONCLUSIONES

96.

CAPÍTULO IV: GENÉTICA
GENÉTICA

97.
97.

INTRODUCCIÓN

98.

Modelo molecular de la respuesta de las plantas al estrés

98.

Herramientas para identificar genes de respuesta a estrés

100.

Identificando genes de respuesta a estrés alcalino en L. tenuis

102.

RESULTADOS

103.

4.1. Procesamiento y ensamblado de ESTs

103.

4.2. Análisis in silico para la identificación de genes expresados bajo condiciones de
alcalinidad.
104.
4.2.1. Análisis de unigenes de hoja

104.

4.2.2. Análisis de unigenes de raíz

105.

DISCUSIÓN

119.

CONCLUSIONES

142.

CAPÍTULO V: SIMBIOSIS
SIMBIOSIS

143.

INTRODUCCIÓN

144.

La rizosfera y las interacciones planta-microorganismo

144.

La simbiosis entre rizobios y Lotus sp.

145.

Inoculantes para especies del género Lotus de interés agronómico

147.

RESULTADOS

150.

5.1. Tolerancia a estrés alcalino y salino de cepas de rizobios
utilizadas como inoculantes para L. tenuis, en condiciones de vida libre

150.

ix

5.2. Eficiencia simbiótica bajo condiciones de alcalinidad.

151.

DISCUSIÓN

156.

CONCLUSIONES

160.

CAPÍTULO VI: CONSIDERACIONES
CONSIDERACIONES FINALES

170.
70.

CAPÍTULO VII: MATERIALES
MATERIALES Y MÉTODOS

173.
173.

7.1. SISTEMA EXPERIMENTAL

174.

7.1.1 Material vegetal

174.

7.1.2. Escarificación de las semillas, siembra y germinación

174.

7.1.3. Sustrato

174.

7.1.4. Soluciones de riego

174.

7.1.5. Sistema experimental

175.

7.1.5.1. Unidad experimental

175.

7.1.5.2. Riego

175.

7.1.5.3. Diseño experimental

176.

7.2. CAPÍTULO II: HOMEOSTASIS IÓNICA Y ARQUITECTURA DEL SISTEMA RADICAL

179.

7.2.1. Selección de la concentración de carbonato a emplear en los ensayos de estrés alcalino

179.

7.2.2. Homeostasis iónica y nutrición

180.

7.2.2.1. Determinación de cationes Na+ y K+

180.

7.2.2.2. Determinación de cloruros

180.

7.2.2.3. Análisis elemental.

181.

7.2.2.4. Determinación de prolina

181.

7.2.3. Arquitectura radical

7.3. CAPÍTULO III: ANATOMÍA Y FISIOLOGÍA
7.3.1. Anatomía

181.

183.
183.

7.3.3.1. Selección del material para procesar.

183.

7.3.3.2. Obtención de preparados semi-permanentes de Epidermis.

183.

7.3.3.3. Obtención de preparados permanentes de cortes histológicos de los diferentes tejidos. 184.
7.3.3.4. Toma y análisis de imágenes
7.3.2. Fisiología
7.3.2.1. Tasa fotosintética, transpiración y conductancia estomática

184.
186.
186.

x

7.3.2.2. Determinación de clorofilas y carotenoides

7.4. GENÉTICA

186.

187.

7.4.1. Elección de Tejidos y tiempos de cosecha.

187.

7.4.2. Extracción de ARN

187.

7.4.3. Síntesis, amplificación y purificación de la población de cDNA.

187.

7.4.4. Sustracción génica

188.

7.4.5. Clonación de secuencias de expresión diferencial

189.

7.4.6. Secuenciación del ADN plasmídico.

190.

7.4.7. Análisis “in silico” para la identificación de genes expresados bajo condiciones de
alcalinidad

190.

7.4.7.1. Depuración de las secuencias de ESTs.

191.

7.4.7.2. Determinación de las secuencias únicas (contigs)

191.

7.4.7.3. Clasificación funcional de los ESTs y realización de análisis comparativos.

191.

7.5. SIMBIOSIS

192.

7.5.1. Cepas Bacterianas

192.

7.5.2.- Medios y condiciones de cultivo bacteriano

192.

7.5.3. Evaluación de la tolerancia a salinidad y alcalinidad de los rizobios bajo condiciones de
vida libre.

193.

7.5.4. Evaluación de eficiencia simbiótica bajo condiciones de estrés

194.

7.5.4.1. Diseño experimental

194.

7.5.4.2. Producción de inoculante e inoculación.

195.

7.5.4.3.- Variables analizadas

195.

7.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

195.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BIBLIOGRÁFICAS

196.
196.

xi

INDICE DE FIGURAS

CAPÍTULO I
FIGURA 1.1. | DISTRIBUCIÓN DE LOS IONES ALREDEDOR DE LOS COLOIDES DEL SUELO.

3.

FIGURA 1.2. | MODELO BIFÁSICO DE CRECIMIENTO.

9.

FIGURA 1.3. | DEFICIENCIA NUTRICIONAL PROVOCADA POR VALORES DE PH ELEVADOS.

12.

FIGURA 1.4. | LA PAMPA DEPRIMIDA.

14.

FIGURA 1.5.| LOTUS TENUIS.

16.

CAPÍTULO II
FIGURA 2.1. | TRANSPORTE DE IONES EN LA PLANTA.

23.

FIGURA 2.2. | PROTEÍNAS DE TRANSPORTE IMPLICADAS EN LA TOLERANCIA AL ESTRÉS SALINO.

25.

FIGURA 2.3. | EJEMPLOS DE VARIACIÓN EN LA ARQUITECTURA RADICAL

27.

FIGURA 2.4. | TOPOLOGÍA RADICAL.

29.

FIGURA 2.5. | RESPUESTA DE L. TENUIS A CONCENTRACIONES ASCENDENTES DE CARBONATOS.

32.

FIGURA 2.6. | DESARROLLO DE VÁSTAGOS Y RAICES DE PLANTAS DE L. TENUIS EXPUESTAS A
DIFERENTES TIPOS DE ESTRÉS.

34.

FIGURA 2.7. | CONTENIDO DE IONES EN HOJAS Y RAÍCES DE PLANTAS DE L. TENUIS EXPUESTAS A
DIFERENTES CONDICIONES DE ESTRÉS

FIGURA 2.8. | CONTENIDO DE PROLINA EN PLANTAS DE L. TENUIS CULTIVADAS EN DIFERENTES
CONDICIONES DE ESTRÉS

36.
39.

FIGURA 2.9. | LONGITUD RADICAL ESPECÍFICA

41.

FIGURA 2.10. | RAÍCES EXTENDIDAS DE L. TENUIS SOMETIDAS A DISTINTOS NIVELES DE
ALCALINIDAD Y SALINIDAD.

44.

CAPÍTULO III
FIGURA 3.1. | PLASTICIDAD ADAPTATIVA AL AMBIENTE.

61.

FIGURA 3.2. | DIFERENTES TIPOS DE ADAPTACIÓN DE LAS PLANTAS ANTE LAS CONDICIONES DE
ESTRÉS SALINO.

63.

FIGURA 3.3. | PLASTICIDAD FENOTÍPICA EN LOTUS TENUIS.

65.

FIGURA 3.4. | ÁREA FOLIAR DE HOJAS DE L. TENUIS COMPLETAMENTE EXTENDIDAS, COMO
CONSECUENCIA DE LA EXPOSICIÓN A DIFERENTES TRATAMIENTOS SALINOS.

67.

FIGURA 3.5. | ESPESOR DE LA CUTÍCULA Y ALTO DE LAS CÉLULAS DE LA EPIDERMIS ABAXIAL DE
HOJAS DE L. TENUIS EXPUESTAS A DIFERENTES CONDICIONES DE ESTRÉS.

68.

FIGURA 3.6. | CORTES TRANSVERSALES DE HOJA.

70.

FIGURA 3.7. | EPIDERMIS FOLIAR. A) ANÁLISIS COMPARATIVO DE LA ANATOMÍA FOLIAR QUE
AFECTAN LA TRANSPIRACIÓN.

71.

FIGURA 3.8. | CONTENIDO DE PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS EN HOJAS DE PLANTAS DE L. TENUIS
EXPUESTAS A DIFERENTES CONDICIONES DE ESTRÉS.

73.

FIGURA 3.9. | PARÁMETROS FOTOSINTÉTICOS EVALUADOS EN HOJAS DE L. TENUIS EXPUESTAS A
DIFERENTES CONDICIONES DE ESTRÉS.

74.

FIGURA 3.10. | CARACTERÍSTICAS DE TEJIDO EPIDÉRMICO.

76.

xii

FIGURA 3.11. | CORTES TRANSVERSALES DE TALLO CON CRECIMIENTO PRIMARIO.

78.

FIGURA 3.12. | DIÁMETRO Y NÚMERO PROMEDIO DE LOS VASOS XILEMÁTICOS EN TALLOS EN
ESTADO DE CRECIMIENTO PRIMARIO.

79.

FIGURA 3.13. | TALLO EN ESTADO DE CRECIMIENTO SECUNDARIO.

81.

FIGURA 3.14. | CORTES TRANSVERSALES DE RAÍCES CON CRECIMIENTO PRIMARIO.

84.

FIGURA 3.15. | CORTES TRANSVERSALES DE RAÍCES CON DESARROLLO DE CRECIMIENTO
SECUNDARIO.

87.

CAPÍTULO IV
FIGURA 4.1. | MODELO GENERAL DE LA RESPUESTA VEGETAL AL ESTRÉS ABIÓTICO

99.

FIGURA 4.2. | REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE LAS DIFERENTES ETAPAS DEL
PROCESAMIENTO Y ENSAMBLADO DE LOS ESTS

103.

FIGURA 4.3. CLASIFICACIÓN FUNCIONAL DE LOS UNIGENES DE HOJA Y DE RAÍZ

CAPÍTULO V
FIGURA 5.1. | PROCESO DE NODULACIÓN DE LOTUS SPP.

146.

FIGURA 5.2. | EVALUACIÓN DE LA TOLERANCIA A PH Y NACL POR EL MÉTODO DE DILUCIÓN EN
PLACA.

150.

FIGURA 5.3. | PARÁMETROS CON DIFERENCIAS SIGNIFICATIVAS EN INTERACCIÓN CEPA X
SOLUCIÓN.

155.

CAPÍTULO VII
FIGURA 7.1. | SISTEMA EXPERIMENTAL.

177.

FIGURA 7.2. | ETAPAS DE ACLIMATACIÓN.

178.

FIGURA 7.3. | ESQUEMA DE ZONAS DE CORTE.

185.

FIGURA 7.4. | ESQUEMA DE LA PCR DE HIBRIDACIÓN SUSTRACTIVA Y SUPRESORA.

189.

xiii

INDICE DE TABLAS

CAPÍTULO I.
TABLA 1.1. | DEFINICIÓN DE SUELOS SALINOS Y SÓDICOS.

5.

CAPÍTULO II.
TABLA 2.1. | BIOMASA DE PLANTAS EXPUESTAS A DIFERENTES TIPOS DE ESTRÉS

34.

TABLA 2.2. | EFECTO DE LOS TRATAMIENTOS SOBRE LA CONCENTRACIÓN DE NUTRIENTES EN
HOJAS DE L. TENUIS.

38.

TABLA 2.3. | VALORES DE LONGITUD TOTAL DE RAÍCES Y CONTRIBUCIÓN AL LARGO TOTAL DE
CADA ORDEN DE RAMIFICACIÓN RADICAL.

40.

TABLA 2.4. | PATRONES DE RAMIFICACIÓN

42.

TABLA 2.5. | LONGITUD TOTAL DE LINKS EXTERNOS Y LINKS INTERNOS EN RAÍCES DE L. TENUIS
SOMETIDAS A ESTRÉS ALCALINO, SALINO Y MIXTO.

42.

TABLA 2.6. | ANÁLISIS COMPARATIVO DE LOS PARÁMETROS TOPOLÓGICOS Μ Y A ENTRE LOS
SISTEMAS RADICALES DE PLANTAS DE L. TENUIS.

43.

TABLA 2.7. | DISTRIBUCIÓN DE NÚMERO DE ÁPICES A LO LARGO DEL EJE RADICAL PRINCIPAL.

45.

CAPÍTULO III
TABLA 3.1. | ANÁLISIS COMPARATIVO DE LA ANATOMÍA FOLIAR QUE AFECTA LA TASA DE
FOTOSÍNTESIS

69.

TABLA 3.2. | NÚMERO DE CÉLULAS ESTOMÁTICAS Y CÉLULAS EPIDÉRMICAS POR HOJA

72.

TABLA 3.3. | MEDICIONES ANATÓMICAS EN TALLO DE L. TENUIS EN ESTADO DE CRECIMIENTO
PRIMARIO.

76.

TABLA 3.4. | APORTE RELATIVO DE LOS DISTINTOS TEJIDOS AL ÁREA TOTAL DEL TALLO EN
ESTADO DE CRECIMIENTO PRIMARIO.

77.

TABLA 3.5. | ANÁLISIS COMPARATIVO DE LA ANATOMÍA DEL TALLO CON CRECIMIENTO
SECUNDARIO

82.

TABLA 3.6. | ANÁLISIS COMPARATIVO DE LA ANATOMÍA DE RAÍZ PRIMARIA

85.

TABLA 3.7. | ANÁLISIS COMPARATIVO DE LA ANATOMÍA DE RAÍZ SECUNDARIA

86.

CAPÍTULO IV
TABLA 4.1. | CLASIFICACIÓN FUNCIONAL DE UNIGENES DE HOJA

107.

TABLA 4.2. | CLASIFICACIÓN FUNCIONAL DE UNIGENES DE RAÍZ

114.

CAPÍTULO V
TABLA 5.1. | ETAPAS CRÍTICAS EN EL ESTABLECIMIENTO DE LA SIMBIOSIS LOTUS SP - RHIZOBIUM

148.

TABLA 5.2. | RESPUESTA DE LOTUS TENUIS A LA INOCULACIÓN CON 3 CEPAS RIZOBIANAS BAJO
CONDICIONES DE ESTRÉS ALCALINO Y MIXTO ALCALINO-SALINO.

152.

TABLA 5.3. | DETALLE DE LOS VALORES DE CADA TRATAMIENTO.

153.

CAPÍTULO VII
TABLA 7.1. | COMPOSICIÓN DE LA SOLUCIÓN DE RIEGO HOAGLAND 0,5X

175.

TABLA 7.2. | TRATAMIENTOS. CARACTERÍSTICAS DE LAS DIFERENTES SOLUCIONES DE RIEGO.

178.

xiv

TABLA 7.3. | ETAPAS DE DESHIDRATACIÓN, ACLARACIÓN, IMPREGNACIÓN E INCLUSIÓN DE
MUESTRAS.

184.

TABLA 7.4. | MEDIO DE CULTIVO BACTERIANO YEM

192.

TABLA 7.5. | SOLUCIÓN DE RIEGO PARA PLANTAS EVANS (1970)

193.

TABLA 7.6. | FACTORES Y NIVELES DE ENSAYO DE EFICIENCIA SIMBIÓTICA.

194.

xv

RESUMEN
El estrés salino representa un problema ambiental de amplia distribución a nivel mundial y
ha sido objeto de innumerables estudios. A pesar de los esfuerzos dirigidos a solucionar
este problema, un aspecto importante que no se ha tenido presente es aquel producido por
sales alcalinas, lo que genera un estrés salino-alcalino. Un ejemplo de ello es el hecho que
9

del área cultivada, cerca de 0,34 × 10 ha (23%) representa suelos salinos y otro 0,56 × 10

9

ha (37%) son sódicos. La sodicidad está dada mayoritariamente por sales como NaHCO3 y
-2

Na2CO3 que en solución producen altas concentraciones de carbonato (CO3 ) y bicarbonato
(HCO3-). Las consecuencias de esta alcalinización son la precipitación de fósforo, hierro y
micronutrientes lo que repercute sobre la fisiología de las plantas, produciendo clorosis,
inhibición en el crecimiento y adaptaciones morfológicas. Este problema representa uno de
los principales factores limitantes en los suelos de La Pampa Deprimida (Provincia de
Buenos Aires), principal zona de cría ganadera del país, donde cerca del 68 % de su
superficie (4,75 millones ha) se encuentran afectados por suelos con problemas de salinidad
y

sodicidad

(Natracuoles,

Natraculafes,

etc).

Estos

suelos,

conocidos

como

hidrohalomórficos limitan la producción de forraje y por ende la productividad de la región,
sostenida sobre la base de praderas naturales e implantadas donde leguminosas
tradicionales como el trébol y la alfalfa no prosperan.
En este sentido, L. tenuis es una especie herbácea, perenne, de porte postrado con elevado
potencial forrajero para la región. Su importancia radica en que esta especie, oriunda del
Mediterráneo, se ha propagado y naturalizado exitosamente en la Pampa Deprimida,
particularmente en los suelos hidrohalomórficos. Parte del éxito de esta especie radica en
su alta tolerancia a la salinidad y al anegamiento, así como a su capacidad de crecer en un
amplio rango de valores de pH y de niveles de nutrientes. En base a esto, el principal
objetivo de este trabajo fue contribuir al conocimiento de los mecanismos de tolerancia al
estrés alcalino, salino y mixto salino-alcalino en L. tenuis. Para ello, evaluamos bajo
condiciones de laboratorio los mecanismos de respuesta a nivel anatómico, fisiológico,
morfológico y molecular en plantas de L. tenuis sometidas al estrés provocado por la sal
neutra NaCl (Hoagland 0,5X + 100 mM, pH 5,8), la sal alcalina NaHCO3 (Hoagland 0,5X +
10 mM, pH 8,0) y el estrés mixto salino-alcalino (Hoagland 0,5X + NaCl 90 mM + NaHCO3
10 mM, pH 8,0) comparado con un control (Hoagland 0,5X, pH 5,8). De esta manera, se
cultivaron plántulas de L. tenuis durante un mes en tubos de PVC de 8 cm de diámetro por
20 cm altura con sustrato arena, irrigadas con un sistema automático de riego por goteo que
reemplazaba diariamente la solución manteniendo las macetas a capacidad de campo.
De esta manera, observamos que bajo condiciones de alcalinidad las raíces de las plantas
adoptan un patrón morfológico tendiente a maximizar la adquisición de recursos del
sustrato, con una mayor asignación de los recursos hacia el desarrollo de las raíces,

xvi

contrastando significativamente con el tratamiento salino donde se produjo una inhibición
del sistema radical. También observamos variaciones en cuanto la homeostasis nutricional
2+

bajo las diferentes condiciones de estrés, registrando una deficiencia de Zn
2+

+

condiciones de alcalinidad y de B, Mg , K y Ca

2+

bajo

bajo condiciones de salinidad. El estrés

mixto presentó exhibió una combinación de ambos tipos de estrés. Estos cambios a nivel
morfológico también fueron acompañados por modificaciones a nivel anatómico y fisiológico
en el vástago y en las raíces, que se vieron acompañadas por cambios adaptaciones a nivel
fisiológico.
Por otro lado, con el fin de identificar genes de respuesta a estrés alcalino, construimos una
librería de cDNA obtenida mediante la técnica de hibridación supresiva y substractiva, tanto
de hoja como de raíz. De esta manera, identificamos genes candidatos de respuesta al
estrés alcalino que fueron clasificados en 11 grupos funcionales: 1) Metabolismo; 2)
Proteínas multifuncionales de ácidos grasos; 3) Transcripción; 4) Transporte y homeostasis
iónica; 5) Transducción de señales; 6) Rescate celular y defensa; 7) Crecimiento y
desarrollo; 8) Destinación Proteica; 9) No clasificados; 10) Función desconocida y 11)
Secuencias que no se alinearon con ninguna secuencia conocida. En este sentido, un
aspecto interesante fue el hecho de identificar genes que codifican para proteínas
relacionadas con la absorción de ciertos nutrientes. Esto sugiere que las mismas permiten a
la planta compensar la disminución de la disponibilidad y/o de la capacidad de adquisición
de los mismos, bajo una condición de estrés alcalino.
Finalmente, estudiamos el efecto de la interacción de la planta con diferentes cepas de su
par simbiótico rizobiano, con el fin de identificar posibles respuestas adaptativas
relacionadas con esta asociación. De esta manera, se evaluó el grado de tolerancia en
condiciones de vida libre de las cepas bajo condiciones de estrés salino y alcalino. Por otro
lado, se evaluó la eficiencia simbiótica bajo condiciones de alcalinidad. En este sentido, se
observó que cepas más tolerantes a la alcalinidad, y aisladas de suelos alcalinos,
presentaron mayor eficiencia simbiótica bajo condiciones de estrés alcalino.
Estos resultados permiten comprender la respuesta adaptativa de L. tenuis para sobrellevar
los factores ambientales restrictivos, una vez que la alcalinidad provoca, entre otras cosas,
una disminución en la disponibilidad de nutrientes y dificultad de la planta para asimilarlos.

xvii

ABREVIATURAS

AA: Espectrometría de Absorción Atómica
ABRE: Elemento de Respuesta a Ácido abscísico
ANOVA: Análisis de Varianza (del inglés, Analysis of variance)
ARE: Elemento de Respuesta a AP-1 (del inglés AP-1 Response Element)
DCD: Doble Capa Difusa
DELLA (proteínas que son reguladores negativos de la señalización de giberelinas
DRE: Elemento de Respuesta a Sequía (del inglés, Drought Response Element)
DREB: Unión de elementos que responden a la deshidratación (del inglés, drought responsive
element binding protein)
ESP: Porcentaje de Sodio Intercambiable (del inglés Exchangeable Sodium Percentage)
EST: marcador de secuencia expresada (del inglés expressed sequence tag)
FBN: Fijación Biológica del Nitrógeno
HATS sistema de transporte de alta afinidad (de high-affinity transport system
HSE: Elemento de Respuesta a Choque Térmico (del inglés, Heat Shock Response Element)
HSP: Proteína de Respuesta a Choque Térmico (del inglés, Heat Shock Protein)
HSS: Hibridización Substractiva y Supresiva
ICP : Espectrometría de Masa (del inglés Inductively Coupled Plasma)
LATS sistema de transporte de baja afinidad (, del inglés Low affinity transport system
LTRE: Elemento de Respuesta a bajas temperaturas (del inglés, Low Temperature Responsive
Elements)
MAPK: Proteínas Quinasas Activadas por Mitógenos (del inglés, Mitogen-Activated Protein
Kinase)
PCR: Reacción en cadena de la Polimerasa (del inglés Polymerase Chain Reaction)
PGPM: Microorganismos Promotores del Crecimiento (del inglés Plant Growth Promoting
Microorganisms)
UTRs: Región no traducida (del inglés, untranslated región)
WSP: Proteínas del Estrés Hídrico (del inglés, Water Stress Protein)

CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN

CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN
GENERAL

1.

CAPÍTULO I – INTRODUCCIÓN GENERAL

INTRODUCCIÓN
La salinidad como factor abiótico limitante para la productividad
vegetal.
Salinidad de los suelos
Los suelos afectados por sales constituyen un problema ambiental de amplia
distribución a nivel mundial, que limita severamente la producción agrícola (Tester &
Davenport, 2003). Dichos suelos pueden clasificarse en dos grupos principales, con
diferentes propiedades físico-químicas y consecuencias para el desarrollo de las
plantas: los suelos salinos, que representan alrededor del 23% de la superficie de
tierra cultivada en todo el mundo (0,34 × 109 ha) y los suelos sódicos abarcan
alrededor del 37% de la misma (0,56 × 109 ha) (Tanji, 1990).
La mayor parte de las sales que afectan los suelos son de origen natural, resultantes
de la erosión de la roca madre. Dicho proceso libera cloruros de sodio, calcio y
magnesio, y en menor grado carbonatos y sulfatos. Dentro de las sales liberadas, el
NaCl es la más soluble y abundante. Los vientos oceánicos y las lluvias también
contribuyen a la salinización de los suelos (Munns & Tester, 2008).
Otra fuente de salinización de los suelos es la originada a partir de la actividad
humana, la cual es denominada genéricamente como salinización secundaria. En este
caso, la salinización se origina principalmente por actividades de sobrepastoreo,
deforestación y métodos inadecuados de riego, entre otras causas.
El tipo de salinidad de un suelo depende de las características de las sales que lo
afectan, y de las propiedades fisicoquímicas de sus componentes particulados.
Generalmente, las partículas coloidales del suelo son portadoras de cargas negativas,
atrayendo de esta manera cationes tales como Ca2+, Mg2+, Na+ y K+ u óxidos de
aluminio cargados positivamente. De esta manera, en la proximidad inmediata de la
superficie cargada negativamente, hay una alta concentración de cationes (región ésta
denominada doble capa difusa, DCD), mientras que la concentración aniónica es
aproximadamente cero (Figura 1.1.). El equilibrio entre los iones de la DCD y la
solución libre es dinámico. De esta manera, los iones de la solución libre están en un
rápido equilibrio de intercambio con los iones de la doble capa. Cuando la

2.

.

CAPÍTULO I – INTRODUCCIÓN GENERAL

concentración de la solución disminuye, algunos iones de la DCD se movilizan a la
solución libre, recuperándose de esta manera el equilibrio. De esta forma, los cationes
adsorbidos pueden ser desplazados por otras especies catiónicas. Este proceso
reversible ocurre normalmente entre las fases sólida y líquida del suelo y se llama
intercambio

catiónico.

Generalmente

todas

las

especies

catiónicas

pueden

intercambiarse entre sí de esta manera, pero el grado en que un catión puede
reemplazar a otro, depende de la fuerza de retención del catión adsorbido.

COLOIDE

DOBLE CAPA DIFUSA
Capa de
Helmholtz

SOLUCIÓN DE SUELO

Capa difusa

Figura 1.1. | Distribución de los iones alrededor de los coloides del suelo. La
mayoría de las partículas coloidales del suelo poseen sus superficies cargadas
electrostáticamente. Existen diversos modelos que explican la adsorción de los iones a
los coloides, siendo los más conocidos los modelos de Chapman – Guoy y de Stern. El
primero considera que hay una capa eléctrica negativa y rígida en la superficie de los
coloides, la cual está equilibrada por una capa difusa de iones; mientras que en el
segundo, suguiere que esta capa difusa consta de dos partes, denominadas en
conjunto doble capa difusa (DCD), las cuales están separadas entre sí por un plano
que define una capa interna rígida (capa de Helmholtz) y una capa externa difusa de
iones. Según Fassbender (1982), el espesor de la DCD depende primordialmente de la
carga de los iones involucrados y de la concentración de la solución del suelo. Cuanto
mayor sea la carga de los iones, menor será el espesor de la DCD y, mientras menor
sea la concentración de la solución del suelo, más densa será la DCD. El espesor de
la DCD define la distancia hasta la cual actúan las fuerzas de retención del coloide
sobre los iones del suelo, estableciéndose así el espacio que tiene el suelo para
acumular los iones intercambiables; aquellos iones que quedan por fuera de la DCD
constituyen la solución externa o solución del suelo y son los que están disponibles
para la planta o para ser lixiviados, proceso que determina pérdidas de nutrientes. La
DCD tiene efectos sobre varias propiedades del suelo como la floculación y la
dispersión de coloides y por tanto en la estructura del mismo; además, afecta el pH y el
comportamiento de su fertilidad (Adaptado de Fassbender, 1982).

3.

.

CAPÍTULO I – INTRODUCCIÓN GENERAL

La salinidad es la acumulación de sales solubles en el suelo, o sea, las sales disueltas
en la solución del suelo. Está dada por la presencia de una fuente de sales y por
condiciones ambientales que determinan que los procesos de acumulación
predominen sobre aquellos de eliminación de las mismas (Drab, 1981). Normalmente
la salinidad de un suelo se mide a partir del extracto acuoso del mismo mediante la
determinación de la conductividad eléctrica (CE), y se expresa en mmhos—cm-1,
resultando la inversa de la resistencia eléctrica. Este valor refleja la cantidad de sales
disueltas en la solución de suelo (Figura 1.1.). Cuanto mas alta es la concentración de
sales de un extracto de suelo, más elevada es su conductividad eléctrica. Los suelos
afectados por salinidad normalmente muestran valores de CE de 2 a 20 dS m -1 en sus
extractos (Tabla 1.1). Las principales sales involucradas en este proceso son los
aniones Cl- y SO42- (especialmente en sus formas sódicas), y en menor medida los
aniones CO3- y HCO3 (como sales de Ca+2 y Mg+2).
La sodificación, por su parte, se inicia con un aumento en el contenido relativo de Na+
en la solución del suelo con relación a los niveles de otros cationes como Ca+2 y Mg+2,
lo que determina un incremento relativo de este ión en el complejo de intercambio
catiónico. Debido a la baja densidad de carga del Na+ , se produce el incremento del
espesor de la DCD y el hinchamiento de las arcillas, lo que lleva a la dispersión y
desestructuración del suelo. Genralmente se admite que para que el Na+ altere la
estructura del suelo en forma negativa, el porcentaje de este catión de intercambio
(ESP, del inglés Exchangeable Sodium Percentage) debe superar el valor crítico del
15%, o sea Na+/S > 15% (donde S es la suma de todos los cationes absorbidos)
(Cisneros et al, 2007). En los casos en que la sodicidad está provocada por sales
como NaHCO3 y Na2CO3, el suelo presenta además problemas de alcalinidad. En este
caso, las arcillas saturadas con sodio, en presencia de agua de lluvia y CO2 disuelto se
hidrolizan liberando Na+ y OH- a la solución del suelo, incrementando así su valor de
pH a valores superiores a 8.
Para mayores detalles acerca de la descripción de estas definiciones, ver Tabla 1.1.

4.

.

CAPÍTULO I – INTRODUCCIÓN GENERAL

Tabla 1.1 | Definición de suelos salinos y sódicos. Clasificados de acuerdo con el Laboratorio de
Salinidad USDA (USSL, 2005). (Adaptado de Munns, 2005)
Efecto sobre el
crecimiento de la
planta

Término

Definición

Descripción

Comentario

Salinidad

Los suelos salinos
poseen una alta
concentración de sales
solubles. Se definen
como tales cuando su
CE es ≥ 4 dS m-1.

Esta definición de
salinidad deriva de una
alta CE, lo cual reduce
los rendimientos de los
principales cultivos de
interés agronómico. Sin
embargo, muchos
cultivos son muy
sensibles, y ya a CE < 4
dS m-1 se ven afectados
significativamente.

El crecimiento de
las plantas se ve
inhibido por los
componentes
osmótico e iónico
que
característicos del
estrés salino.

La CE es la conductividad
eléctrica del extracto de
suelo, y refleja la
concentración de sales en
suelos saturados. Se
considera que una
conductividad igual a 4
dS—m-1 es equivalente a
40 mM de NaCl.

Sodicidad

Los suelos sódicos
poseen bajas
concentraciones de
sales solubles, pero un
alto porcentaje de iones
Na+ en el complejo de
intercambio (ESP >
15%).

Esta definición de
sodicidad deriva del
contenido de Na+ en el
complejo de
intercambio, el cual
provoca la
desestructuración de las
arcillas del suelo debido
al desplazamiento por el
Na+ de cationes
divalentes unidos a las
cargas negativas de las
partículas de arcilla.

La falta de
estructura del
suelo inhibe el
crecimiento de las
raíces.

A altas ESP, las
partículas de arcilla se
separan. El suelo drena
pobremente y se inunda
cuando hay exceso de
precipitaciones. También
adquiere una
consistencia dura cuando
se seca.

Los suelos alcalinos
son un tipo de suelo
sódico con un elevado
pH. SE caracterizan por
tener un ESP ≥ 15 y un
pH de 8,5 – 10.

El alto valor de pH es
debido
fundamentalmente a la
presencia de
carbonatos.

El elevado pH
afecta la
solubilidad de
macro y
micronutrientes y
por ello, la
disponibilidad de
los mismos para
las plantas
(Figura 1.2.)

5.

.

CAPÍTULO I – INTRODUCCIÓN GENERAL

Respuesta de las plantas al estrés
Las plantas son organismos sésiles que deben adaptarse a las condiciones
ambientales a las cuales se encuentran sometidas. En este sentido, las condiciones y
características de los suelos en los que se desarrollan definen en gran medida su
nutrición mineral, su fisiología y su homeostasis. Como consecuencia, las plantas que
se desarrollan bajo una condición de estrés provocada por la presencia de un exceso
de sales, despliegan una serie de modificaciones fisiológicas, morfológicas y
moleculares como respuesta a la misma.
El estrés vegetal puede definirse como una circunstancia adversa que perturba la
función fisiológica de un individuo (Munns & Tester, 2008). Este concepto no es
aplicable a los rápidos ajustes de flujos metabólicos que ocurren en respuesta a
cambios ambientales “normales” a los que están expuestas cotidianamente las
plantas. Un ejemplo clásico es el cambio de la tasa fotosintética como consecuencia
del sombreado provocado por una nube. Por el contrario, el concepto de estrés se
aplica en aquellos casos en que un agente estresante induce un cambio fisiológico tal
que, como resultado del mismo, existe una reducción en el crecimiento; una respuesta
fisiológica, una adaptación o una combinación de todas ellas. Sin embargo, esta
definición puede ser confusa, ya que una situación de estrés leve puede modificar el
metabolismo vegetal e incrementar la actividad fisiológica de una planta, sin causar
efectos dañinos (Lichtenthaler, 1996). En estos términos, el estrés debe ser
considerado como un fenómeno dosis-dependiente, donde bajas dosis de un agente
estresante pueden estimular el metabolismo y el crecimiento, mientras que altas dosis
pueden tener un efecto inverso y negativo, una vez excedido cierto umbral.
Se han identificado diferentes respuestas de las plantas ante una situación de estrés.
Las mismas pueden desencadenarse en forma aislada, o bien como combinaciones de
unas con otras y/o variar según el genotipo, la especie o el estadio fenológico en el
cual se encuentre la planta. Dichas respuestas son:
- Tolerancia: hace referencia a la capacidad de una planta para enfrentar a un
ambiente no favorable, manteniendo activo su metabolismo (Taiz & Zeiger, 2006).
Estos mecanismos de respuesta tienden a mantener altas tasas de actividad
metabólica aun cuando la planta se encuentre expuesta a dosis significativas de
estrés, mientras que disminuyen su metabolismo bajo un estrés menos severo. En

6.

.

CAPÍTULO I – INTRODUCCIÓN GENERAL

relación con esto, es preciso recordar que un ambiente estresante para una planta
puede no serlo para otra.
- Evasión: implica la disminución de la actividad metabólica ante situaciones
desfavorables, de manera tal que la planta ingresa en un estado de latencia que le
permite sobrellevar dicha situación. Ciertas especies vegetales que habitan en
ambientes extremos utilizan esta estrategia, que les permite completar su ciclo de vida
en periodos estacionales favorables, evitando de esta manera el estrés típico de
estaciones extremas.
Normalmente, las plantas suelen poseer varios mecanismos de evasión y tolerancia, o
una combinación de ambos (Orcutt & Nielsen, 2000).
- Aclimatación: se puede decir que una planta se encuentra aclimatada cuando
aumenta su tolerancia a un tipo particular de estrés como consecuencia de una
exposición previa al mismo (Taiz & Zeiger, 2006). Las plantas tienen la habilidad de
ajustar su fisiología y sus atributos estructurales ante un factor estresante. Por
ejemplo, a largo plazo (temporadas), debido a la forma de crecimiento modular que
presentan, las plantas pueden producir la abscisión de determinadas partes para luego
rebrotar dando origen a estructuras con características anatómicas, químicas y
morfológicas diferentes. En cambio, en plazos cortos (minutos), la planta responde al
estrés alterando diversas actividades metabólicas, tales como por ejemplo la
modificación de los niveles y las concentraciones relativas de proteínas y/o la
modificación de los niveles de distintos reguladores del crecimiento. Por lo tanto, la
aclimatación, se puede considerar como una respuesta fenotípica a los cambios en el
ambiente.
- Adaptación: se refiere al nivel de resistencia genética determinado, adquirido por un
proceso de selección durante muchas generaciones (Taiz & Zeiger, 2006). Ocurre por
varios mecanismos que evolucionaron a nivel de la población, y a través de sucesivas
generaciones. Se asume que genotipos específicos con una apropiada combinación
de genes, son dominantes en una población que se desarrolla en un ambiente
estresante (Orcutt & Nielsen, 2000).

Tipos de estrés salino y sus consecuencias para el desarrollo de las plantas
En función de lo mencionado anteriormente, es posible reclasificar el estrés salino
natural en tres tipos diferentes:

7.

.

CAPÍTULO I – INTRODUCCIÓN GENERAL

A- Estrés salino neutro (producido por sales neutras como NaCl).
B- Estrés alcalino (provocado por sales alcalinas como el NaHCO3 y el Na2CO3)
C- Estrés mixto salino-alcalino (provocado por una mezcla de sales neutras y
sales alcalinas) (Shi & Sheng, 2005a).

A) Estrés salino:
Uno de los estreses abióticos mejor caracterizados es el salino propiamente dicho,
provocado por la presencia excesiva de sales neutras. Se considera que una planta se
encuentra bajo estrés salino, cuando la concentración iónica de la rizosfera se ha
incrementado a niveles que afectan la función fisiológica normal o la vitalidad vegetal
(Munns, 2002). La salinidad en los suelos provoca la inhibición del crecimiento de las
plantas por dos razones fundamentales. En primer lugar, reduce su capacidad para
incorporar agua. Este proceso es denominado generalmente como efecto osmótico.
En segundo lugar, las sales pueden ingresar en los organismos vegetales a través del
flujo de transpiración y eventualmente dañar las células en las hojas, lo que conlleva
(al igual que el estrés provocado por el efecto osmótico) a una reducción en el
crecimiento. Este efecto ión-específico se produce por la acumulación de las sales en
los tejidos, y junto con el estrés osmótico, da lugar a un crecimiento vegetal en dos
fases en respuesta a la salinidad (Figura 1.2.).
En la primera fase antes mencionada, el efecto sobre el crecimiento es resultante de la
acumulación de las sales en el suelo (o sea sin ingresar a la planta), lo que provoca la
reducción del crecimiento de las hojas y, en menor extensión, del crecimiento de las
raíces (Munns, 2002). Los procesos celulares y metabólicos involucrados en esta
primera fase son similares a los mecanismos de respuesta descriptos en plantas
afectadas por la sequía. En esta etapa, se considera que las concentraciones de Na+ y
Cl- no son suficientes como para ejercer efectos tóxicos sobre los tejidos y que el
floema no contiene niveles excesivos de sales, ya que las células en estado de
crecimiento y elongación son capaces de incluir las sales que provienen del xilema
dentro de sus vacuolas en expansión.
La segunda fase de la respuesta de crecimiento resulta del efecto tóxico derivado de la
presencia de las sales dentro de la planta. A raíz del continuo transporte de sales
hacia las hojas, las sales incorporadas se van concentrando mayoritariamente en las
hojas maduras. Este exceso de sales en las hojas, (constituído principalmente por Na+
y Cl-), provoca su senescencia. La causa del daño es debido probablemente, a que la

8.

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CAPÍTULO I – INTRODUCCIÓN GENERAL

cantidad de sal acumulada excede la capacidad de acumulación en las vacuolas. De
esta manera, las sales se concentran rápidamente en el citoplasma e inhiben la
actividad enzimática. Alternativamente, pueden acumularse en las paredes celulares y
deshidratar a la célula.

Figura 1.2. | Modelo bifásico de crecimiento. Ante la imposición instantánea del
estrés salino, el crecimiento se reduce inicialmente por el efecto osmótico. A
medida que transcurre el tiempo, la acumulación de iones tóxicos desencadena la
segunda fase de inhibición del crecimiento (estrés iónico). Variedades sensibles y
tolerantes serían igualmente afectadas por el déficit hídrico, evidenciándose la
tolerancia diferencial a la salinidad durante la segunda fase. (Adaptado de Munns
& Teermat, 1986)

Por lo descripto para la fase iónica del proceso de estrés, se asume que la tasa de
defoliación de la planta es crucial para su supervivencia. Si las hojas nuevas son
continuamente producidas a tasas mayores que las tasas de defoliación, siempre
existirán suficientes hojas fotosintéticamente activas que permitan que la planta pueda
completar su ciclo de vida. Sin embargo, si la senescencia de hojas viejas es más
rápida que la generación de hojas jóvenes, la planta no podrá sobrevivir.
Por su parte, en plantas cultivadas bajo condiciones de salinidad provocada por sales
neutras se activa una compleja maquinaria de respuestas adaptativas, las cuales
ocurren tanto a nivel de la planta entera como a nivel celular, estando ambas
relacionadas entre sí (Munns & Tester, 2008). Parte de las respuestas tienden a
mantener la homeostasis celular, la actividad metabólica y el crecimiento, lo que
permite a la planta completar su ciclo de vida aún en condiciones desfavorables.
Ejemplo de ello es el amplio conocimiento que se posee sobre los diferentes
transportadores de iones presentes en la membrana plasmática y en el tonoplasto, así

9.

.

CAPÍTULO I – INTRODUCCIÓN GENERAL

como también de los mecanismos de síntesis de solutos compatibles que contribuyen
a mantener un potencial osmótico adecuado en el citoplasma (Tester & Davenport,
2003).
Se han identificado tres mecanismos de adaptación de las plantas al estrés salino: a)
el ajuste osmótico; b) la exclusión de Na+ o Cl-, y c) la capacidad de los tejidos a
acumular Na+ o Cl- (Munns & Tester, 2008). Las adaptaciones mencionadas
anteriormente implican cambios globales en la expresión de genes, y el conocimiento
de tales cambios contribuye al entendimiento de las bases genéticas y moleculares de
la tolerancia, así como también al diseño de estrategias de mejoramiento genético
tendientes a obtener cultivares tolerantes a la salinidad (Zhang et al, 2004; Munns,
2005).

B) Estrés alcalino:
En contraposición al estrés salino, el conocimiento referente a los mecanismos de
respuesta al estrés alcalino es extremadamente escaso aún. En forma similar a lo que
ocurre para el estrés salino, es esperable que existan diversos mecanismos
involucrados en la tolerancia al estrés alcalino, y que estos actúen a varios niveles, ya
sea molecular, celular o de planta entera.
La alcalinidad es definida como la concentración de álcalis solubles con la capacidad
de neutralizar ácidos (Bailey, 1996). La alcalinidad de los suelos se debe
principalmente a la presencia de los aniones bicarbonato (HCO3-) y carbonato (CO32-).
Por su parte, se considera que los iones hidróxido, borato, amonio, junto con las bases
orgánicas, los fosfatos y los silicatos participan en menor medida de la misma
(Petersen, 1996).
Algunas veces la alcalinidad es confundida con pH alcalino. Un pH alcalino o elevado
es causado por una alta proporción de iones OH- en comparación con la proporción de
iones H+ (Handreck & Black, 2002). Cuando los valores de pH son superiores a 11,0,
el anión OH- es un factor importante de alcalinidad. A valores de pH neutros o
ligeramente superiores a 7, los aniones HCO3- y CO32- son generalmente los factores
causales de la alcalinidad, y junto con el ácido carbónico (H2CO3) y el CO2, son
conocidos genéricamente como especies del carbonato o sistema carbónico (Lindsay,
1979). De esta manera, el agua puede tener altos niveles de pH debido a los iones de
hidróxido, pero puede no tener una elevada alcalinidad. Asimismo, el agua puede
tener un pH ácido pero puede considerarse que genera alcalinidad si los álcalis están
presentes. Esta definición es importante una vez que en suelos afectados por

10.

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CAPÍTULO I – INTRODUCCIÓN GENERAL

alcalinidad, la misma está dada mayoritariamente por sales como NaHCO3 y Na2CO3,
las cuales en solución producen altas concentraciones de carbonato (CO3-2) y
bicarbonato (HCO3-).
Los síntomas más notables de la alcalinidad excesiva en plantas constituyen la
inducción de una clorosis internerval en las hojas jóvenes y la detención del
crecimiento (Lucena et al., 2007). Estos síntomas se atribuyen mayoritariamente a la
reducción de la solubilidad de nutrientes debido al incremento del pH (Bailey, 1996).
En este sentido, elevados valores de pH en el suelo provocan una disminución en la
Capacidad de Intercambio Aniónico (CIA) y un aumento en la Capacidad de
Intercambio Catiónico (CIC) lo que determina una alteración de los balances de
cargas, y a su vez condiciona a la nutrición vegetal.
Por otro lado, en condiciones de alcalinidad ocurre un aumento en la volatilización del
NH3, reduciendo su disponibilidad. Algo similar ocurre en valores de pH>6 con la
disponibilidad del fósforo, debido a la formación de complejos Ca-P. También es
característico de este tipo de estrés, la reducción en la disponibilidad de B a valores de
pH>7. Finalmente, se considera que la disponibilidad para las plantas de
micronutrientes (entre ellos Fe, Mn2+, Cu2+ y Zn2+) se reduce entre 10 y 100 veces para
cada unidad de incremento de pH edáfico. (Figura 1.3.) (Cartmill et al., 2008; ValdezAguilar & Reed, 2008).
Ante estas circunstancias, como mecanismo de respuesta al estrés alcalino, las
plantas deben regular el pH intracelular y el rizosférico mediante la producción y
liberación de compuestos orgánicos ácidos, lo que representa un costo energético
significativo (Yang et al., 2007).

11.

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CAPÍTULO I – INTRODUCCIÓN GENERAL

A

B

Figura 1.3. | Deficiencia nutricional provocada por valores de pH elevados. A) Influencia del pH
sobre la disponibilidad de nutrientes para la planta en la solución del suelo. El ancho del área de
cada ión refleja la disponibilidad relativa del mismo. El recuadro amarillo señala la disponibilidad de
nutrientes en un rango de pH de 7,5 – 8,5. (Adaptado de Epstein & Bloom, 2005). B) Respuesta de
diferentes especies ornamentales cultivadas a altos valores de pH. Se observan síntomas de
deficiencia de hierro, clorosis progresiva (amarillamiento de las hojas jóvenes) (Adaptado de Pennisi,
2005)

C) Estrés mixto salino-alcalino:
El conocimiento acerca de los mecanismos de respuesta al estrés mixto salinoalcalino, al igual que lo referido al estrés alcalino, son muy escasos y los mismos
constituyen objetivos prioritarios de un creciente número de investigaciones. A priori,
se considera que este tipo de estrés debe resultar más severo que el estrés salino y el
estrés alcalino en forma individual, ya que combina los efectos osmótico e iónico
(típicos del estrés salino) con las deficiencias nutricionales provocadas por el estrés
alcalino (Shi at al, 2005a).

12.

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CAPÍTULO I – INTRODUCCIÓN GENERAL

La Pampa Deprimida
La Pampa Deprimida es una vasta región llana que abarca aproximadamente 90.000
Km2, ubicada en el centro-este de la Provincia de Buenos Aires (Soriano et al, 1992)
(Figura 1.4.). Esta región presenta un paisaje con relieve extremadamente llano
caracterizado por la presencia de suelos con distintos grados de alcalinidad, salinidad
e hidromorfismo, distribuidos en forma de mosaico por toda el área (Figura 1.4.B). La
zona se destaca por sufrir las consecuencias de un régimen pluvial irregular,
caracterizado por la alternancia de períodos normales con otros de excesos o déficit
de lluvias, lo que constituye un serio obstáculo para el desarrollo agropecuario.
Como resultado de esta heterogeneidad ambiental, más del 60% de los suelos de la
Pampa Deprimida son azonales, complejos halo-hidromórficos y asociaciones
fuertemente influenciadas por inundaciones (Natraquolls, Natraqualfs, Natralbolls, y
Argialbolls) con zonas bien drenadas (Hapludols y Argiudolls) restringidas a las áreas
elevadas (vulgarmente denominadas como Medias Lomas y Lomas) (Figura 1.4.B).
Estas características generan un complejo mosaico de tipos de suelos caracterizados
en mayor o menor medida por factores limitantes al crecimiento vegetal. En este
sentido, la alcalinidad representa uno de los principales factores limitantes
(representado mayoritariamente por sales de NaHCO3 y Na2CO3), seguido por el
anegamiento y el exceso de Na+ intercambiable a distintas profundidades del perfil
edáfico, y cuyas intensidades varían según las distintas zonas y épocas del año
(Figura 1.4.A) (INTA-SAGyP, 1990).
Las características topográficas de la región limitaron originalmente su producción
agrícola, y alrededor del 80% de su superficie se encuentra cubierta por pastizales
naturales y pasturas implantadas, aunque en los últimos años, y como consecuencia
de la extensión de la frontera agrícola, dicha superficie se vio significativamente
disminuida. La vegetación de tales pastizales está constituida por un mosaico de
comunidades vegetales asociadas a los suelos más altos, medios, bajos dulces y
bajos salino-alcalinos (León, 1975). La composición actual de especies responde a
variaciones locales topográficas y a la salinidad del suelo, pero históricamente se ha
visto alterada por un siglo de pastoreo continuo (León et al., 1984; Sala et al., 1986).

13.

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CAPÍTULO I – INTRODUCCIÓN GENERAL

A

B

Figura 1.4. | La Pampa Deprimida.
A: Unidades cartográficas afectadas por condiciones de alcalinidad. Se puede observar que
los suelos alcalinos constituyen un área significativa de la Pampa Deprimida (Adaptado del Instituto
de Suelos - INTA CASTELAR).
En recuadro, se localizan las áreas ecológicas de la pradera pampeana a la cual pertenece la
Pampa Deprimida: (1) pampa ondulada, (2) pampa sub-húmeda central, (3) pampa semiárida
central, (4) pampa austral, (5) pampa mesopotámica y (6) pampa deprimida. En azul: isohietas
(en mm/año). En verde: isotermas (en grados centígrados). Adaptado de Viglizzo & Pordomingo,
2002.
B: Características de perfil de suelo en la Pampa Deprimida. Se identifican tres regiones según
las características del perfil: la Loma (zonas más altas); la Media loma (zonas de transición) y el
Bajo (zonas más deprimidas). Estas últimas presentan regularmente problemas de salinidad,
alcalinidad y anegamiento. Adaptado de León et al, 1975.

14.

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CAPÍTULO I – INTRODUCCIÓN GENERAL

La principal actividad económica de la zona es la ganadería de baja productividad,
tomando como referencia el resto de las subregiones pampeanas. Esta actividad se
asienta en el aprovechamiento del campo natural, aunque el decaimiento progresivo
de los pastizales debido a un manejo irracional (sobrepastoreo y excesivo pisoteo)
ocasionó la pérdida de especies útiles y su reemplazo por otras especies que se han
adaptado a las condiciones edáficas limitantes de la región. Esta situación podría aún
empeorarse, debido a que el incremento relativamente reciente de las actividades
agrícolas en la región ha provocado el desplazamiento de las actividades ganaderas
hacia zonas edáficas marginales en términos de productividad vegetal (Fernández et
al., 2007). Sin embargo, a pesar de las restricciones naturales, la potencialidad
ganadera del área es alta y el incremento en la eficiencia productiva del sistema
ganadero representa un desafío tecnológico importante.

Las leguminosas mejoran el valor forrajero de los pastizales.
Una de las características más destacadas de las leguminosas es su aporte en
términos del valor productivo y nutritivo durante el invierno. Es un hecho muy
reconocido por los productores que los pastizales compuestos por gramíneas y
leguminosas producen mayor cantidad de materia seca que aquellos que solo
contienen gramíneas (Taylor & Allinson, 1983, Guretzky, 2004). Esto se debe en parte
a la Fijación Biológica de Nitrógeno (FBN) desarrollada en simbiosis con rizobacterias,
proceso que permite a las leguminosas incrementar el nitrógeno mineral (N) del suelo
y su disponibilidad para las gramíneas (Guretzky, 2004). La transferencia de N desde
las leguminosas hacia el suelo proviene de las raíces en descomposición y los
residuos de las hojas, provocando un incremento en el valor nutricional y el
crecimiento de las especies vegetales asociadas (Guretzky, 2004, Tilman, 1982). Las
leguminosas también presentan elevados niveles de proteína cruda, y su asociación
con gramíneas de estación fría puede mejorar la distribución estacional y la calidad del
forraje producido (Guretzky, 2004).
Se han realizado numerosos esfuerzos para incorporar leguminosas “tradicionales”
como el trébol blanco, el melilotus y la alfalfa como fuente de nitrógeno y forraje de
calidad para suelos alcalinos deficientes en fósforo y con escaso drenaje, tales como
los que caracterizan a la Pampa Deprimida del Salado. Sin embargo, los resultados
han sido poco satisfactorios en estos ambientes, ya que el establecimiento de estas

15.

.

CAPÍTULO I – INTRODUCCIÓN GENERAL

especies se ha visto dificultado por fallas en su implantación y/o persistencia. (Montes,
1988).

Lotus tenuis y su potencialidad como forrajera en suelos de la Pampa Deprimida
El género Lotus comprende alrededor de doscientas especies anuales y perennes,
ampliamente distribuidas en todo el mundo. La zona de mayor diversidad específica es la
Cuenca del Mediterráneo Europeo, probable centro de origen del género (Montes, 1988;
Langer, 1990). En las últimas décadas, las especies del género Lotus han adquirido
importancia como forrajeras debido a su buena respuesta productiva en un amplio rango
de tipos de suelos (Blumenthal & McGraw, 1999; García et.al., 1994).

A

B

C

D

Figura 1.5.| Lotus tenuis. A) Ilustración que presenta las características morfológicas
generales; B) Flores; C) Vainas; D) L. tenuis en campo.

L. tenuis (2n=2x=12) es una especie herbácea, perenne, de porte postrado con elevado
potencial forrajero (Montes, 1988). Hasta hace unos años, su denominación científica era
Lotus glaber (ex Lotus tenuis Miller), pero a raíz de un reciente Congreso de Botánica se
ha oficializado la denominación de mayor uso entre los productores de la región
(Kirkbride, 2006). Se trata una especie alógama estricta (auto-incompatible), con elevada
variabilidad genética y plasticidad fenotípica, lo cual podría explicar en parte su tolerancia
al estrés salino (Schachtman & Kelman, 1991; Stofella et al, 1998; Kade et al, 2003,
Teakle et al, 2006) y su gran potencial de uso en áreas afectadas por salinidad creciente
(Dear et al, 2003). Por otro lado, una característica agronómica interesante de esta
especie es su alta capacidad de producción de semillas (Montes, 1988; Stofella et al,

16.

.

CAPÍTULO I – INTRODUCCIÓN GENERAL

1998; Kade et al, 2003). L. tenuis también tolera un amplio rango de valores de pHs
(entre 4,8 y 9,0) (Montes, 1988), y el anegamiento simultáneo (Vignolio et al,1999;
Mendoza et al, 2005; Striker et al., 2005). Asimismo, se desarrolla bien en climas
templado-fríos a templado cálidos, en praderas húmedas a muy húmedas, con
temperaturas promedio anuales entre los 7 y los 17 °C y precipitaciones medias anuales
de 400 a 1200 mm (Montes, 1988). En comparación con otras leguminosas consideradas
tradicionales como las mencionadas anteriormente, L. tenuis es una especie que se
desarrolla muy bien en suelos pobremente drenados y alcalinos y con baja concentración
de fósforo soluble (Mendoza, 1981; Mendoza et al., 2005). Todas estas propiedades
explican el proceso de invasión biológica positiva que esta especie ha desarrollado en
suelos de tales características, en un lapso menor a un siglo.
Según algunos autores, esta leguminosa fue introducida accidentalmente (probablemente
como contaminación de semillas de Lotus corniculatus) en la Pampa Argentina a mitad
del siglo pasado (Montes 1988; Miñon et al, 1990; Vignolio et al., 1999) logrando una
naturalización tan singular como exitosa (Insausti et al, 1995). Constituye una especie
pionera de colonización en claros de pasturas y por ello, aprovecha los frecuentes
disturbios que ocurren en la vegetación producidos por las labores agrícolas, el
sobrepastoreo, el fuego en comunidades de paja colorada (Paspalum quadriforium) o las
inundaciones (Laterra et al, 2006). Existe información que demuestra claramente que
estos procesos facilitan significativamente su dispersión e implantación (Vignolio et al.,
1999).
Otro aspecto importante a mencionar de esta especie es la Fijación Biológica del
Nitrógeno (FBN) que desarrolla, siendo probablemente la leguminosa exótica más
conspicua en los pastizales de la Pampa Deprimida. En varios trabajos se ha demostrado
que presenta interacciones positivas (disponibilidad de N) con la comunidad vegetal
asociada debido a que modifica las condiciones físicas y/o bióticas del suelo donde se
implanta (Quinos et al., 1998).

17.

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CAPÍTULO I – INTRODUCCIÓN GENERAL

OBJETIVOS
Objetivo General:
Contribuir al conocimiento de los mecanismos de tolerancia de L. tenuis al estrés
salino, alcalino y la combinación de ambos (estrés salino-alcalino).

Objetivos Particulares:
1. Caracterizar la respuesta de la arquitectura radical de L. tenuis relacionando
parámetros de crecimiento con la homeostasis iónica bajo condiciones controles y
bajo estrés.
2. Caracterizar las adaptaciones anatómicas y fisiológicas de L. tenuis bajo
condiciones de crecimiento controlado y bajo situaciones de estrés.
3. Caracterizar la respuesta genética de L. tenuis bajo condiciones de crecimiento
controlado y bajo condición de estrés alcalino identificando algunos de los genes
involucrados en los posibles mecanismos de tolerancia.
4. Evaluar la respuesta de L. tenuis a la alcalinidad y al estrés salino-alcalino cuando
el mismo se encuentra en simbiosis con cepas seleccionadas según su tolerancia y
eficiencia simbiótica bajo condiciones de estrés similares.

18.

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CAPÍTULO I – INTRODUCCIÓN GENERAL

HIPÓTESIS


Los mecanismos de respuesta de Lotus tenuis al estrés salino, al estrés alcalino y
al estrés mixto salino-alcalino pueden ser evidenciados a través de evaluaciones
fisiológicas, anatómicas y morfológicas.



La respuesta de Lotus tenuis al estrés alcalino es diferente a la respuesta al estrés
salino. Por otro lado, el estrés mixto salino-alcalino es más severo y diferente del
estrés salino o del estrés alcalino por separado.



El estrés alcalino induce una respuesta a nivel genético, activando la expresión de
genes tendientes a mantener la homeostasis de la planta y contribuir al desarrollo
de mecanismos de tolerancia



La inoculación con cepas rizobianas adaptadas y seleccionadas por su eficiencia
simbiótica bajo condiciones de estrés alcalino, mejoran la respuesta adaptativa de
L. tenuis a dicha condición.

19.

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CAPÍTULO II: HOMEOSTASIS
IÓNICA Y ARQUITECTURA DEL
SISTEMA RADICAL

20.

CAPÍTULO II. HOMEOSTASIS IÓNICA Y ARQUITECTURA RADICAL

INTRODUCCIÓN
El crecimiento de las plantas es afectado por los factores limitantes del ambiente en el
que se desarrollan. En este sentido, un aspecto importante del crecimiento de la planta
y su capacidad adaptativa es la alopatía (del inglés allocation), o asignación de
recursos (Grime, 1979). Este fenómeno permite a la planta redistribuir sus recursos
entre el vástago y las raíces en función de las condiciones ambientales, y de esta
manera asegurar la tasa de captura de los mismos (Poorter et al, 1990). Cuando una
planta reencuentra restricciones en los niveles de recursos requeridos para mantener
su máximo crecimiento (estrés por deficiencia), es esperable que su respuesta
involucre una alopatía compensatoria con el fin de maximizar la adquisición del
recurso limitante (Bloom et al, 1985). Como ejemplo, las plantas pueden incrementar la
asignación de recursos para el vástago cuando la luz es un factor más limitante que
los nutrientes, y para las raíces cuando los nutrientes son más limitantes que la luz
(Bloom et al, 1985). De esta manera, la asignación de materia seca entre el vástago y
las raíces durante el crecimiento (asignación de crecimiento) representa el resultado
integrado de varios procesos, que operan a diferentes escalas de tiempo, e involucran
numerosos controles genéticos y ambientales (Cannell & Dewar, 1994).
Las condiciones ambientales que provocan daños fisiológicos para las plantas (estrés
tóxico) inducen respuestas específicas, generalmente reduciendo las tasas de
crecimiento y la adquisición de recursos (Chapin, 1991). En particular, el exceso de
iones (estrés salino) o de alcalinidad en el medio externo, provocan desbalances en la
disponibilidad de nutrientes minerales y en su adquisición o distribución dentro de la
planta, pudiendo incrementar los requerimientos de elementos esenciales (Grattan &
Grieve, 1992).

Homeostasis iónica.
El flujo de agua provocado por la transpiración foliar produce el movimiento de sales
desde las raíces hasta las hojas. En las raíces, los solutos que ingresan siguiendo el
flujo de transpiración, se mueven por el simplasto y por el apoplasto. Los solutos que
son transportados por esta última vía y son capaces de atravesar la membrana de las
células de la endodermis radical, continúan su transporte por el simplasto hasta
alcanzar el xilema (Figura 2.1.). En teoría, el movimiento de iones por el apoplasto se
interrumpe en la endodermis: la impermeabilidad de las paredes de las células
endodérmicas engrosadas con suberina y lignina (banda de Caspary) impiden el libre

21.

CAPÍTULO II. HOMEOSTASIS IÓNICA Y ARQUITECTURA RADICAL
flujo (Figura 2.1.C.). En este punto, los iones deben atravesar la barrera selectiva de
las membranas para continuar su camino hacia los vasos del xilema (Clarkson, 1996).
En todo este camino hacia el sistema xilemático, el flujo de iones encuentra células
especializadas, con un sistema vacuolar desarrollado, donde los sistemas de
transporte a través de membranas plasmática o vacuolar descritos previamente
pueden contribuir a la selectividad en el transporte de iones a las hojas (Jeschke,
1984).
Los transportadores de membrana que translocan minerales desde el suelo hacia la
planta y median su distribución en forma pasiva o activa, desempeñan un papel clave
en la homeostasis iónica. En caso de la distribución pasiva, el movimiento de los iones
ocurre a favor de un gradiente de concentración, en tanto que el movimiento activo
implica la energización de transportadores por el gradiente electroquímico generado
por bombas de protones, también conocidas como H+-ATPasas (Figura 2.2.). El
potencial de membrana de las células vegetales puede alcanzar valores cercanos a
los -200mV. Esto favorece en gran medida el transporte pasivo de cationes como el
Na+ hacia el interior de la célula, especialmente cuando existen altas concentraciones
extracelulares de dicho catión, como en el caso del estrés salino (Chinnusamy & Zhu,
2004). El Na+ acumulado en el interior de la célula puede funcionar como el principal
osmolito inorgánico (Yang et al, 2007) y favorecer así el ajuste osmótico, pero luego de
un cierto tiempo bajo estrés y una vez sobrepasados ciertos niveles intracelulares de
dicho catión, esta acumulación puede perjudicar el funcionamiento normal de la célula.
Un aspecto a tener en cuenta por su importancia en la adaptación y supervivencia de
las plantas en condiciones de salinidad es la capacidad de las mismas de mantener la
homeostasis iónica en tales condiciones. Cuando la salinidad del suelo es alta, y/o el
pH es igual o superior a 8,5, la distribución de cationes de las células vegetales puede
verse alterada (Niu et al, 1995) y un considerable número de nutrientes, tales como el
P, Fe y Zn2+ pueden tornarse deficientes (Clark, 1982; Marchner, 1995).
En el caso del estrés salino, el alto contenido de sales (como Na+) generalmente altera
el balance de nutrientes, causando una toxicidad ión-específica, además de perturbar
la regulación osmótica (Mengel & Kirkby, 2001; Ashraf & Harris, 2004). Esta situación
causa efectos adversos a nivel bioquímico y fisiológico sobre el crecimiento y
desarrollo de la planta, (Munns, 2002). Los altos niveles de Na+ inhiben asimismo la
absorción de Ca2+ y K+, lo cual resulta en un antagonismo Na+/K+. Algunas especies de
plantas se adaptan a elevadas concentraciones de sales disminuyendo el potencial
osmótico de sus tejidos, por medio de la acumulación de solutos inorgánicos como Na+
y K+ (Asch et al, 2000), así como también solutos orgánicos y aminoácidos libres
(generalmente prolina) (Zhu, 2001, Ashraf & Harris, 2004). .

22.

CAPÍTULO II. HOMEOSTASIS IÓNICA Y ARQUITECTURA RADICAL

A)

B)
Cutícula
Epidermis superior
Mesófilo en
empalizada

Haz vascular
Xilema
Floema

Epidermis inferior
Estomas
Células oclusivas

Mesófilo esponjoso

C)

23.

CAPÍTULO II. HOMEOSTASIS IÓNICA Y ARQUITECTURA RADICAL

Figura 2.1. | Transporte de iones en la planta. A) Al igual que el agua, los iones penetran libremente en
los espacios libres de la corteza radical hasta alcanzar la endodermis, punto en el que las bandas de
Caspary impiden el progreso subsiguiente. Este movimiento de difusión es por definición bidireccional,
como se indica en el paso A de la figura. Las células corticales remueven los iones de los espacios libres
de la corteza a través de procesos mediados por transportadores. El transporte inicial dentro de estas
células es a través de la membrana plasmática hacia el citoplasma (paso B). Una vez ahí, dos rutas
principales siguen; una a través del tonoplasto hacia la vacuola (paso C) y el otro dentro del citoplasma a
través de los plasmodesmos entre células contiguas – movimiento simplástico (paso D). La vía simplástica
de transporte que lleva a la estela y a los elementos conductores del xilema es un sistema abierto, una
vez que dentro de la estela, los iones dejan el simplasto y entran nuevamente a la vía apoplástica de la
estela (paso E y F). Moviéndose a través del xilema (paso J), los iones llegan a las nerviaciones
terminales de las hojas y une vez ahí se mueven libremente (paso K) en los espacios de pared celular del
mesófilo – apoplasto foliar (paso L). Estas células son así bañadas por la solución de iones en forma
similar a la que las células corticales de la raíz son bañadas por la solución en los espacios libres de la
raíz. En forma similar a las células de la raíz, las células del mesofilo foliar acumulan iones de la solución
que las irriga mediante mecanismos de transporte activo (paso M). De esta forma, la mayoría de los iones,
antes de alcanzar el citoplasma de las células foliares deben haber sido transportados a partir de los
espacios extracelulares a través de la membrana plasmática en el citoplasma al menos dos veces: la
primera por las células radicales, y luego nuevamente por las células foliares. Una vez dentro del
citoplasma de la célula foliar los iones deben moverse por la vía simplástica de célula a célula (paso N).
Para una mejor comprensión de los caminos celulares, en las figuras del panel derecho es posible
visualizar en B) la estructura anatómica de una hoja y en C) la estructura anatómica de una raíz en zona
de crecimiento primario (Adaptado de Epstein & Bloom, 2005).

La principal estrategia celular para tolerar la salinidad es el mantenimiento de la
concentración de Na+ citoplasmático por debajo de los límites de toxicidad. Dado que
el ingreso de Na+ a la célula se lleva a cabo por difusión simple siguiendo un gradiente
electroquímico, la homeostasis iónica debe mantenerse removiendo los iones en
exceso del citoplasma. A diferencia de las células animales y las levaduras, las células
vegetales no poseen Na+/K+ ATPasas para el bombeo de estos cationes hacia el
exterior de las células (Schulze et al, 2005). En cambio, las plantas tienden a mantener
las concentraciones de iones Na+ con antiporters que movilizan Na+ hacia el exterior
de la célula o hacia la vacuola, gracias a un mecanismo de transporte del tipo antiporte
Na+/H+, acoplando el movimiento de Na+ en contra del gradiente de concentración, con
el del H+ hacia adentro, a favor del gradiente electroquímico generado por H+-ATPasas
y H+-PPiasas (Parida & Das, 2005) (Figura 2.2.). En forma simultánea, y con el fin de
mantener balance iónico, las células acumulan aniones inorgánicos tales como Cl(Santa-Cruz et al, 2002), NO3- o aniones orgánicos sintetizados por la mismas células
vegetales (Sagi et al, 1997).
Considerando al apoplasto y la vacuola como compartimientos externos a la célula, la
homeostasis iónica se mantiene entonces por la extrusión de iones tóxicos hacia el
apoplasto y/o por su acumulación en la vacuola (Blumwald et al, 2000). La extrusión
de iones puede no ser una estrategia de tolerancia muy viable, dado que la
acumulación de los mismos en el apoplasto impone, rápidamente, un estrés
hiperosmótico en el citoplasma con consecuencias perjudiciales (Flowers et al, 1991;

24.

CAPÍTULO II. HOMEOSTASIS IÓNICA Y ARQUITECTURA RADICAL

Yeo, 1998). Sin embargo, es un mecanismo destacable cuando se tienen en
consideración los fenómenos de redistribución de iones a nivel de la planta entera. En
cambio, la acumulación de iones en la vacuola constituye un mecanismo de tolerancia
de gran importancia, siendo una demostración de ello la inducción de las actividades
H+-ATPasa, H+- PPiasa y el antiporte Na+/H+ en la vacuola bajo condiciones de estrés
salino (Blumwald et al, 2000), así como la inducción de genes que codifican para
antiporters Na+/H+ vacuolares (Yokoi et al, 2002).
Una de las consecuencias negativas de la acumulación de Na+ en la célula, es la
competencia con el K+ y por lo tanto el bloqueo de algunas de las funciones vitales
desempeñadas por este último. Como consecuencia de esto, y teniendo en cuenta
además que el Na+ interfiere con la captación de K+ (Salisbury & Ross, 2000), la
relación Na+/K+ es una forma de estimar la capacidad de la planta de mantener la
homeostasis de K+ bajo condiciones de estrés

Figura 2.2. | Proteínas de transporte implicadas en la tolerancia al estrés salino. La
descripción esquemática de la célula vegetal incluye: vc, vacuola; cp, cloroplasto; mt,
mitocondria; pc, pared celular; mp, membrana plasmática; ∆Ψ, potencial de membrana. El
+
gradiente de protones establecido por H -ATPasas y pirofosfatasas está indicado por +/-. Bajo
+
+
condiciones de estrés salino, el Na y el Cl son secuestrados en la vacuola, mientras que el K
y osmolitos como la prolina están presentes en altas concentraciones en el citosol. Los
símbolos para los diferentes trasportadores localizados en la membrana están identificados por
el ión o protón transportado y por la dirección del movimiento. Para las organelas (mt y cp)
todavía no se han caracterizado transportadores a través de técnicas moleculares. Una Na++
+
ATPasa incluída en la membrana plasmática es hipotética al igual que el antiporter Na /H en la
membrana plasmática (Adaptado de Bohnert and Sheveleva, 2009).

25.

CAPÍTULO II. HOMEOSTASIS IÓNICA Y ARQUITECTURA RADICAL

En el caso de la alcalinidad, el efecto sobre la homeostasis iónica está menos
caracterizado. Cuando una planta está sometida a condiciones de alcalinidad, el alto
costo de mantener el gradiente electroquímico de H+ a nivel de la endodermis podría
ser una de las causas de los efectos negativos de este tipo de estrés (Campbell &
Nishio, 2000; Shi et al, 1998). Como consecuencia de ello se vería sustancialmente
afectado el transporte activo de nutrientes hacia el interior de la planta y la exclusión
de iones tóxicos.

Arquitectura del sistema radical
El sistema radical es extensivo, pero con desarrollo estructurado (Fitter, 1987, 1991;
Hodge et al, 2009). Esta característica puede ser considerada como una respuesta
evolutiva a cada variabilidad espaciotemporal por la disponibilidad de recursos y por
las restricciones asociadas al crecimiento (Harper et al, 1991). Como consecuencia, la
extensión en el tiempo y en el espacio del sistema radical está gobernada por reglas
del desarrollo genéticamente dirigidas, las cuales a su vez son moduladas por las
condiciones ambientales.
La configuración espacial del sistema radical (número y longitud de raíces laterales),
también denominado arquitectura radical, varia ampliamente dependiendo de la
especie vegetal, de la composición del suelo, y particularmente de la disponibilidad de
agua y nutrientes (Malamy, 2005 en Hodge et al, 2009). Las plantas pueden optimizar
su arquitectura radical mediante la iniciación de primordios radicales laterales y
regulando el crecimiento de raíces de primer orden o raíces laterales. Los sistemas
radicales resultan del control coordinado tanto de programas genéticos endógenos
(regulando el crecimiento y la organogénesis) como de la acción de estímulos
ambientales bióticos o abióticos (Malamy 2005 en Hodge 2009). La interacción entre
estas señales intrínsecas y extrínsecas complica aún más la disección de los
mecanismos involucrados.
Dependiendo de la extensión de las raíces laterales relativas al eje primario o principal,
la morfología del sistema radical varía entre un sistema con notable dominancia de un
eje principal hasta un sistema difuso o fasciculado (Figura 2.3.). En el caso particular
de L. tenuis, tal como ocurre en las dicotiledóneas, el sistema radical deriva de la
radícula del embrión, la cual forma una raíz principal y de la formación de raíces
laterales (sistema radical primario), cuyas prolongaciones pueden exhibir crecimiento
radial.

26.

CAPÍTULO II. HOMEOSTASIS IÓNICA Y ARQUITECTURA RADICAL

Figura 2.3. | Ejemplos de variación en la arquitectura radical (obtenidos por excavación parcial en
el suelo). En la hilera superior, los sistemas radicales son pequeños y ramificados, mientras que en la
hilera inferior se caracterizan por ser marcadamente ramificados. El aumento de la dominancia de un
eje principal se incrementa de la izquierda para la derecha (Kutshera, 1960 en Hodge et al, 2009)

Arquitectura radical
Las variaciones de forma entre sistemas radicales pueden ser descriptas utilizando
análisis arquitecturales, que son aproximaciones basadas en el hecho de que la
mayoría de los sistemas radicales pueden ser descriptos asumiendo que su morfología
podría equipararse a la de árboles trivalentes ramificados, para los cuales han sido
desarrolladas descripciones matemáticas, en campos tan diversos como la
neurobiología, paleobiología y geomorfología (Fitter et al, 1991).
El término arquitectura radical ha sido utilizado en varios contextos para hacer
referencia a distintos aspectos de la forma del sistema radical, y se refiere a la
configuración espacial del mismo, como por ejemplo la explicita disposición geométrica
de los ejes radicales. Generalmente, los estudios de arquitectura radical no incluyen
los detalles estructurales finos, tales como los pelos radicales, sino que involucran al

27.

CAPÍTULO II. HOMEOSTASIS IÓNICA Y ARQUITECTURA RADICAL

sistema radical entero o grandes subconjuntos del sistema radical de una planta
individual.
La topología radical hace referencia a la manera en que los ejes radicales individuales
están conectados unos a los otros a través de la ramificación. Como en la terminología
matemática, la topología de la raíz es estable a la deformación o rotación de los ejes
sobre sí mismos y además es posible medir en sistemas radicales excavados.
Como descriptor de múltiples ejes radicales, la arquitectura es taxativamente superior
que la topología y la distribución. Cuando se conoce la arquitectura radical,
inevitablemente se conocen la topología y la distribución. Sin embargo, no se puede
inferir la arquitectura a partir de la topología o de la distribución. A pesar de ello, la
topología y distribución de raíz son los descriptores más comúnmente utilizados en
estudios de forma radical, debido a que son más fáciles de medir que la arquitectura.

Modelado topológico
Existen varias escuelas de modelado topológico de raíces que difieren entre sí en la
forma de asignar los órdenes jerárquicos a los diferentes componentes de la raíz
(Bernston, 1997). En este trabajo, utilizamos el sistema de ordenamiento centrípeto
funcional desarrollado por Fitter (1987). Dicho sistema consiste en representar el
sistema radical por un conjunto de links (o conectores) los cuales unen dos puntos de
ramificación (link interno) o un ápice a un punto de ramificación (link externo) (Figura

2.4.A.). De esta manera se determinan los parámetros topológicos derivados tales
como la magnitud (µ, número de links externos), altitud (a, el recorrido más largo entre
el link externo y el link basal) y la relación entre ambos (Fitter, 2002).
La asignación de valores topológicos se inicia desde los ápices radicales y se
establece fijando órdenes de magnitud crecientes a los puntos de ramificación
siguientes hacia la base. Esta dirección de ordenamiento es funcional una vez que el
orden asignado refleja la distancia topológica desde el ápice radical (Figura 2.4.B.). La
distancia desde los ápices radicales se correlaciona con la edad y puede ser un
importante determinante de la morfología y de la capacidad fisiológica de una sección
de raíz determinada (Clarkson, 1996 en Berntson, 1997).
Estos atributos se utilizan para determinar índices topológicos que representan
atributos de un sistema radical en términos del costo de carbono, de las propiedades
de transporte, del anclaje y de la eficiencia de explotación de los recursos de las
diferentes arquitecturas topológicas (Fitter, 2002; Berntson, 1997). Estos índices

28.

CAPÍTULO II. HOMEOSTASIS IÓNICA Y ARQUITECTURA RADICAL

topológicos varían entre un valor mínimo de 0 y un valor máximo de 1. Cuando estos
valores tienden a cero, indican un patrón topológico del tipo dicotómico, mientras que
cuando tienden al valor uno, se acercan a un patrón topológico del tipo espina de pez
(Figura 2.4.C.).

Sistema de ordenamiento centrípeto funcional
B

A

C

µ=8
a=4
(µ >a)
Pe = 32

µ=a=8
Pe = 43

Patrón Espina de Pez

Patrón Dicotómico

Figura 2.4. | Topología radical. A) Ilustra la magnitud individual para cada link en el sistema y
los valores de los parámetros topológicos. A los links externos (señalizados con una E) se les
asigna una magnitud (µ) de 1, y todos los links internos presentan una magnitud equivalente a la
suma de sus dos links concluyentes desde los meristemas. Nótese que los meristemas radicales
se localizan en que los links externos, y que la magnitud (µ) se corresponde al número de ápices
o meristemas. B) Indica la dirección centrípeta de la asignación de valores topológicos en el
sistema radical (en el modelo centrípeto funcional utilizado en este trabajo es de los links
exteriores hacia la base). C) Representa los patrones topológicos extremos tipo y sus
características topológicas. Para una magnitud específica, el patrón Espina de Pez (izquierda) se
corresponde al modelo con el menor número posible de ramificaciones, mientras y el patrón
Dicotómico (derecha) se corresponde el máximo de ramificaciones posibles. (Adaptado de
Fitter, 1987, Berntson, 1997).

29.

CAPÍTULO II. HOMEOSTASIS IÓNICA Y ARQUITECTURA RADICAL

El patrón dicotómico se caracteriza por tener menos costo de construcción que el
patrón espina de pez y por ser más eficiente en términos de transporte, dado que
posee un menor recorrido desde los ápices hacia la base de la raíz (Fitter, 1987). En
contraste, el patrón espina de pez posee un costo de construcción más alto, pero al
mismo tiempo es más eficiente en hábitats donde los recursos del suelo son escasos,
ya que minimiza la competencia por los nutrientes entre las ramificaciones de la raíz.
De esta manera, el objetivo del presente capítulo fue (1), comparar la respuesta de L.
tenuis al estrés salino, alcalino y mixto salino-alcalino, con respecto a su efecto sobre
el crecimiento, incorporación de nutrientes y morfología de raíz; y (2) identificar
características comunes y distintivas de la respuesta morfológica de las raíces de L.
tenuis al estrés alcalino y mixto salino-alcalino, con respecto al estrés salino neutro.

30.

CAPÍTULO II. HOMEOSTASIS IÓNICA Y ARQUITECTURA RADICAL

RESULTADOS

2.1. Parámetros de crecimiento
Como se mencionó a lo largo de la introducción, el NaHCO3 representa la principal sal
alcalina en los suelos de la Pampa Deprimida (Vázquez et al, 2001). Para poder iniciar
los estudios de alcalinidad en L. tenuis se necesitó previamente determinar las
concentraciones experimentales óptimas de esta sal para imponer restricciones al
crecimiento sin provocar efectos letales sobre las plantas. De esta manera, se analizó
el crecimiento en presencia de diferentes concentraciones de carbonato. Por otra
parte, esta sal raramente se encuentra aislada en el suelo, estando generalmente
asociada a otras sales de sodio, como el NaCl. Es por ello que la respuesta a la
alcalinidad se evaluó en ausencia de NaCl (estrés alcalino) y en presencia de NaCl
(estrés mixto salino-alcalino). Como control de los efectos provocados por la salinidad,
se utilizó un tratamiento con NaCl como sal neutra.

2.1.1. Determinación de concentraciones óptimas para ensayos de alcalinidad en L.
tenuis
Con la finalidad de seleccionar la concentración óptima para realizar los ensayos de
alcalinidad en L. tenuis se cultivaron las plantas en concentraciones crecientes de
NaHCO3. Bajo estas condiciones, mientras que la alcalinidad (o capacidad tampón) de
la solución de riego aumenta en función de la concentración de la sal, el pH oscila
entre 8,0 y 8,5.
En la Figura 2.5. A se puede visualizar el efecto de esta sal sobre la acumulación de
biomasa total de L. tenuis. Bajo estas condiciones, se pudo observar que la alcalinidad
producida a concentraciones de 10 mM de NaHCO3 redujeron la biomasa de las
plantas en un 30% con respecto al control, mientras que concentraciones superiores a
30 mM de NaHCO3 provocaron reducciones superiores al 50 % con respecto al
control.

31.

CAPÍTULO II. HOMEOSTASIS IÓNICA Y ARQUITECTURA RADICAL

Esta reducción tan severa a elevadas concentraciones de bicarbonato fue
acompañada de una coloración marrón de las raíces de las plantas y una visible
reducción de la biomasa de las mismas (Figura 2.5. B).
Bajo estas circunstancias, se seleccionó la concentración de 10 mM de NaHCO3 para
la totalidad de los ensayos que se han realizado en este trabajo de tesis. Esta elección
se justifica debido a que en dicha concentración se observó un efecto significativo
sobre el crecimiento de las plantas pero que el mismo no resultara tan dramático como
para comprometer la supervivencia de la planta.

A

Concentración de NaHCO
Concentración
de NaHCO3

Biomasa total de plantas de L. tenuis sometidas a
concentraciones crecientes de NaHCO3
d (0,5)

50mM

c (0,6)

30mM

b (1,1)

10mM

a (1,3)
0mM
0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

Biomasa
(mg/planta)
Biomasa
(mg/planta)

B
50 mM

30 mM

10 mM

0 mM

Figura 2.5. | Respuesta de L. tenuis a concentraciones ascendentes de
carbonatos. Con la finalidad de seleccionar la concentración óptima para trabajar
con NaHCO3 se evaluó la acumulación de biomasa de L. tenuis bajo diferentes
concentraciones de la sal. A) Biomasa total de plantas de L. tenuis de un mes
sometidas a distintas concentraciones de NaHCO3. Las barras de error representan
el ES y las letras diferentes indican diferencias significativas entre los tratamientos.
Los valores entre paréntesis son los promedios de los valores transformados
(P≤0,01 mediante comparación de medias de Tukey), (n = 3). B) Imágenes de
tamaño de las plantas al finalizar el experimento..

32.


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