A)PCR. Es una prueba para uso en investigación por la que su descubridor,
Kary Mullis, recibió el premio Nobel de química en 1993. Se basa en la propiedad
del ADN de autorreplicarse, por lo que en determinadas condiciones un fragmento
o secuencia de ADN se puede copiar y multiplicar hasta llegar a concentraciones
mensurables. Para el diseño de la PCR, es preciso contar con una serie de
reactivos entre los que destaca la enzima ADN polimerasa, nucleótidos
(elementos básicos de construcción de los ácidos nucleicos) y cebadores o
iniciadores (primers) que son pequeñas cadenas de ADN que si son específicas se
unirán al ADN diana (para formar la doble cadena característica del ADN) y en
condiciones propicias químicas y físicas, irán incorporando nucleótidos hasta
amplificar la secuencia original.
El mecanismo de la PCR es tan simple como su propósito: 1) El ADN doble cadena
(dsADN) es desnaturalizado (separado en cadenas sencillas) por calor. 2) Los
primers se unen a las secuencias compatibles en el ADN cadena sencilla. 3) Los
primers son extendidos por la ADN polimerasa (en dirección 5’ – 3’), dando como
resultado dos copias de la molécula original de ADN doble cadena. Estas tres
etapas comprenden un ciclo de amplificación en la PCR. Cada paso del ciclo debe
ser optimizado por el investigador de acuerdo al ADN molde y el set de primers
utilizados. Este ciclo de amplificación se repite usualmente de 20 – 35
veces y el producto amplificado puede ser analizado. La PCR es muy utilizada
para amplificar el ADN para su posterior uso en otros experimentos. Esta técnica
también tiene aplicaciones en pruebas genéticas o para la detección de ADN
patógeno.
Como la PCR es un método altamente sensible y requiere volúmenes de reacción
muy pequeños, es recomendable la preparación de una mezcla maestra (master
mix) para varias reacciones. La mezcla maestra debe estar bien mezclada y debe
dividirse por el número de reacciones, asegurando que cada reacción contenga la
misma cantidad de enzima, dNTPs y cebadores (primers). Muchos proveedores
ofrecen mezclas de PCR que ya contienen todo, excepto los primers y el ADN
molde.
Las regiones con alto contenido de Guanina/citosina (GC) representan un desafío
en técnicas de PCR convencional. Las secuencias ricas en GC son más estables
que las secuencias con menor contenido (la guanina y la citosina se unen
mediante tres puentes de hidrógeno, mientras que la timina y la adenina se unen
mediante dos). Además, las secuencias ricas en GC tienden a formar estructuras
secundarias, tales como bucles. Como resultado, las cadenas dobles ricas en GC
son difíciles de separar por completo durante la fase de desnaturalización. En
consecuencia, la ADN polimerasa no puede sintetizar la nueva cadena sin
impedimento alguno. Una temperatura de desnaturalización más alta puede
mejorar esto y ajustes hacia una temperatura de unión más alta y un tiempo de
unión más corto, pueden evitar la unión inespecífica de primers ricos en GC.
Ciertos reactivos adicionales pueden mejorar la amplificación de secuencias ricas
en GC. El DMSO, el glicerol y la betaína ayudan a interrumpir las estructuras
secundarias que son causadas por las interacciones GC y por lo tanto facilitan la
separación de las hebras dobles.

ESTUDIO DE LA PANDEMIA
Dr. Sergio J. Pérez Olivero (C) Copyright (24/11/21) All Rights Reserved

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