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DETECCIÓN DE OXIDO DE GRAFENO
EN SUSPENSIÓN ACUOSA (COMIRNATYTM (RD1)

Pablo Campra Madrid
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ESTUDIO OBSERVACIONAL EN MICROSCOPIA ÓPTICA Y ELECTRÓNICA

Informe provisional (I)
28 de Junio de 2021

Prof. Dr. Pablo Campra Madrid
Doctor en Ciencias Químicas y Licenciado en Ciencias Biológicas
ESCUELA SUPERIOR DE INGENIERIA

PÁGINA

Fecha

1/24

28/06/2021

UNIVERSIDAD DE ALMERÍA, ESPAÑA
1

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Pablo Campra Madrid

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AVISO IMPORTANTE

Seguidamente se presenta un estudio microscópico,
observacional y meramente descriptivo de la muestra
problema.
La identificación definitiva del material dominante en la
muestra precisa de ulteriores fraccionamientos y análisis
espectroscópicos específicos que permitan caracterizar la
estructura del material.

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Fecha

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28/06/2021

2

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Antecedentes

Pablo Campra Madrid
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• D. Ricardo Delgado Martín solicita PRESTACIÓN DE SERVICIOS de Investigación a la
UAL denominada:
“DETECCIÓN DE GRAFENO EN MUESTRA DE SUSPENSIÓN ACUOSA”

- El 10/06/2021 se recibe por mensajería 1 vial, etiquetado con el texto siguiente:
- “COMIRNATYTM .Sterile concentrate. COVID-19 mRNA. 6 doses after dilution.
- Discard date/time:PAA165994.LOT/EXP: EY3014 08/2021”

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Fecha

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28/06/2021

-

Procedencia y trazabilidad: se desconoce
Estado de conservación: refrigerado
Mantenimiento durante el estudio: refrigerado
Codificación de la muestra problema a analizar: RD1
3

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Observaciones preliminares de la muestra problema
RD1
Descripción:

- Vial sellado, con goma y tapa de aluminio intactas, de 2ml de capacidad,
conteniendo una suspensión acuosa turbia de 0,45 ml.
- Se realiza extracción y cuantificación de RNA
- Se observa presencia de microbiología nanométrica no caracterizada, visible a 600X
en microscopio óptico

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Procesamiento de la muestra
1. Dilución en suero fisiológico estéril al 0,9% (0,45 ml + 1,2 ml)
2. Fraccionamiento por polaridad: 1,2 ml hexano+120 ul de muestra RD1
3. Extracción de fase hidrofílica
4. Extracción y cuantificación de RNA en la muestra
5. Microscopía electrónica y ópticas de fase acuosa

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28/06/2021

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Análisis preliminar: extracción y cuantificación de Rna en la muestra

Pablo Campra Madrid
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1. Extracción RNA: Kit https://www.fishersci.es/shop/products/ambion-purelink-rna-mini-kit-7/10307963
2. Cuantificación de absorbancia UV total en espectrofotómetro
NanoDrop™ https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-2000#/ND-2000
3. Cuantificación específica de Rna por fluorescencia
QUBIT2.0: https://www.thermofisher.com/es/es/home/references/newsletters-and-journals/bioprobes-journalof-cell-biology-applications/bioprobes-issues-2011/bioprobes-64-april-2011/the-qubit-2-0-fluorometer-april2011.html

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Espectro de absorción UV de la fase acuosa de la
muestra RD1
(Equipo Nano-drop)

Máximo de absorción de la MUESTRA RD1 (260-270 nm)

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28/06/2021

- RNA. Presenta máximos habituales a 260 nm. Concentración total estimada por fluorometria QUBIT2.0 : 6 ng/ul
- El espectro revela presencia de elevada cantidad de sustancias o sustancia diferentes al Rna con máximo de absorción en la
misma región, con un total estimado en 747 ng/ul (estimación no calibrada)
- El oxido de grafeno reducido (RGO) presenta máximos de absorción a 270 nm, compatibles con el espectro obtenido
(Thema et al, 2013. Journal of Chemistry ID 150536)
- El máximo de absorción obtenido NO PERMITE DESCARTAR la presencia de grafeno en la muestra. La cantidad mínima de
RNA detectado por QUBIT2.0 sólo explica un porcentaje residual de la absorción total UV de la muestra.

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OBJETIVO: Identificación microscópica de derivados de grafeno

1. Toma de imágenes en microscopia óptica y electrónica
2. Comparativa con imágenes de literatura y patrón de oxido de grafeno
reducido
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METODOLOGIA:

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28/06/2021

8

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Microscopio electrónico JEM-2100Plus
Tensión: 200 kV

Resolución 0,14 nm
Aumento hasta x1.200.000
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MICROSCOPIA ELECTRONICA DE TRANSMISIÓN
(TEM)

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MICROSCOPIA ELECTRONICA DE TRANSMISIÓN
(TEM)
La microscopía electrónica (TEM) se utiliza habitualmente para obtener imágenes de
nanomateriales de grafeno. Se ha convertido en un instrumento bastante estándar y fácil de
usar que es capaz de obtener imágenes de láminas de grafeno en capas individuales.

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10/24

28/06/2021

10

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DESCRIPCIÓN DE LA IMAGEN anterior

Pablo Campra Madrid
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(de: Choucair et al, 2009. Gram-scale production of graphene based on solvothermal synthesis and sonication. Nature
Nanotechnology 4(1):30-3

• Figura 2: “Imágenes TEM de las láminas de grafeno aglomeradas. La
misma región de muestra se ve con diferentes aumentos y muestra
claramente el grado de formación de la lámina y la tendencia de las
láminas a fusionarse en regiones superpuestas. Es evidente una
estructura inherente en forma de lámina que muestra una intrincada
matriz de pliegues de largo alcance. Como las imágenes se toman en
modo de transmisión, la opacidad relativa de las láminas individuales
es el resultado de regiones interfaciales con superposición entre
láminas individuales. Las láminas se extienden en dimensiones
laterales sobre escalas de longitud micrométrica, que van desde 100
nm hasta más de 1.000 nm.”

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28/06/2021

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RESULTADOS: Comparativa de muestra problema (RD1) con una imagen TEM
de literatura
MUESTRA RD1
Choucair et al 2009. Nature Nanotechnology 4(1):30-3 Fig 2

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28/06/2021

200 12nm

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RESULTADOS: DESCRIPCIÓN DE LAS IMAGENES TEM DE LA MUESTRA PROBLEMA RD1

Pablo Campra Madrid
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Las imágenes TEM de la muestra RD1 en general PRESENTAN UNA ELEVADA SEMEJANZA con
imágenes de oxido de grafeno de literatura obtenidas por la misma técnica TEM, con aumentos
parecidos. Se puede observar una intrincada matriz o malla de láminas flexibles translucidas
plegadas sobre sí mismas, con mezcla de aglomeraciones multicapa más oscuras y de monocapas
no plegadas de color mas claro. Aparecen zonas lineares más oscuras debidas a la superposición
local de láminas y a la disposición local de láminas individuales en paralelo al haz de electrones.
Tras la malla aparece una elevada densidad de formas claras redondeadas y elípticas sin
identificar, posiblemente correspondientes a orificios generados por forzamiento mecánico de la
malla durante el tratamiento. Mostramos aquí 3 imágenes con aumento progresivo:

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• NOTA importante: Para una IDENTIFICACIÓN definitiva del GRAFENO
por TEM, es necesario complementar la observación con la
caracterización estructural mediante obtención por EDS de un
PATRÓN DE DIFRACCIÓN DE ELECTRONES característico (como la
figura b mostrada abajo). El patrón correspondiente al grafito o el
grafeno presenta una simetría hexagonal, y generalmente cuenta con
varios hexágonos concéntricos. No ha sido posible por el momento
obtener este patrón por la escasez de muestra disponible para su
procesamiento, y la disposición caótica y la densidad de los
pliegues.

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Matéria (Rio J.) 23 (1) • 2018 • Characterization of graphene nanosheets obtained by a modified
Hummer's method. Renata Hack et al.

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Objetivos PLAN Fluor de 10x, 20x (DIC) y 40x
(DIC)
Ocular: 10x
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Microscopio Biológico
CX43

• Condensador ajustado en
posición intermedia con efecto
3D (entre campo Claro (BF) y
campo oscuro (DF)

Microscopio Óptico

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PATRON DE OXIDO DE GRAFENO REDUCIDO

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28/06/2021

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INDENTIFICACIÓN DE OXIDO DE GRAFENO Y SUS CARACTERISTICAS ESTRUCTURALES
POR MICROSCOPIA OPTICA

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Los materiales de grafeno esencialmente constan de una sola capa atómica. Esto hace que la observación del microscopio
óptico basado en absorbancia sea difícil, aunque es posible adquirir imágenes ópticas de láminas de grafeno suspendidas bajo
luz transmitida de campo claro ( Fig. a ). El grafeno oxidado (GO) tiene un color mucho más pálido que le reducido (rGO).
Sin embargo, bajo iluminación reflectante, la obtención de imágenes ópticas de alto contraste de grafeno e incluso láminas de
GO se ha reportado en literatura. Modificando el ángulo de incidencia de la iluminación, mediante ajuste apropiado del
condensador (campo claro y campo oscuro), esta ha sido la técnica empleada para aumentar el contraste en muestra RD1 del
presente informe y obtener imágenes de la rugosidad en la superficie de las láminas con efecto 3D.

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a) Campo claro. b-d) Microscopía de extinción de fluorescencia (FQM)
Kim et al, 2010. Seeing graphene-based sheets, Materials Today, Volume 13, 2010,Pages 28-38,

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Imagen de literatura
TEM de bajo aumento

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“La figura muestra una imagen TEM de grafeno bicapa con bordes que tienden a
enrollarse y doblarse ligeramente”
Qian, W., Hao, R., Hou, Y. et al. Solvothermal-assisted exfoliation process to
produce graphene with high yield and high quality. Nano Res. 2, 706–712
(2009).

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28/06/2021

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IMAGENES DE LITERATURA. MICROSCOPIA ELECTRONICA A BAJO AUMENTO
MICROSCOPIA ELECTRONICA DE BARRIDO (SEM) (a) y (b) y TRANSMISION (TEM) (c) y (d)

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Effects of Graphene Nanosheets with Different Lateral Sizes as Conductive Additives on the Electrochemical Performance of
LiNi0.5Co0.2Mn0.3O2 Cathode Materials for Li Ion Batteries. Figure 2. SEM images of different graphene sheet sizes: (a) GN-13 and (b) GN-28,
and transmission electron microscopy (TEM) images of different graphene sheet sizes: (c) GN-13 and (d) GN-28.

Husu et al. Polymers 2020, 12(5), 1162

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pen AccessLetter
Robust Magnetized Graphene Oxide
Platform for In Situ Peptide Synthesis and
FRET-Based Protease Detection
Kim et al, Sensors 2020, 20(18), 5275

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28/06/2021

Figure 1. Preparation and characterization
of graphene oxide (GO) and magnetic
graphene oxide (MGO). (A) Schematic of
MGO synthesis procedure. (B) Optical
microscopy image of MGO. (C) Magnetic
hysteresis loop of MGO. (D) UV/Vis
absorption spectra of GO and MGO. (E) FTIR spectra of GO and MGO.
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Comparativa de muestra RD1 al microscopio óptico con imágenes del patrón de
OXIDO DE GRAFENO REDUCIDO (rGO)

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Las imágenes ópticas de las láminas presentes en la muestra RD1 revelan gran similitud con las láminas exfoliadas a partir de
sonicación del patrón rGO. Ambas muestras presentan láminas translúcidas interiormente rugosas, con perfiles irregulares,
plegadas sobre sí mismas y con tendencia a enrollarse en los bordes. Las formas y dimensiones de las láminas son muy
variables, presentando en ambas muestras láminas en cintas o bandas plegadas sobre sí mismas (ribbons).

En el ANEXO adjunto se muestran imágenes alternas de MUESTRA PATRON DE rGO y
MUESTRA PROBLEMA RD1

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https://cen.acs.org/articles/86/i4/Graphene-Ribbons.html

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CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
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1. El estudio microscópico de la muestra aporta sólidas evidencias de presencia
probable de derivados de grafeno, si bien la microscopía no proporciona una
prueba concluyente. La identificación definitiva de grafeno, grafeno oxidado
(GO) o grafeno oxidado reducido (rGO)en la muestra RD1 precisa de la
CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL mediante el análisis de patrones espectrales
específicos comparables a los publicados en literatura y a los obtenidos a partir
de muestra patrón, obtenidos con técnicas espectroscópicas como XPS, EDS,
RMN, FTIR o Raman, entre otras.
2. Los análisis de este informe corresponden a UNA SOLA MUESTRA, limitada en
volumen total disponible para procesar. Es por tanto necesario realizar un
muestreo significativo de viales similares para extraer conclusiones
generalizables a muestras comparables, registrando origen, trazabilidad y
control de calidad durante la conservación y transporte previas a los análisis.

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Exención de responsabilidad

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• Los resultados y conclusiones de este informe no implican posición
institucional alguna de la Universidad de Almería
• Ni el Investigador Principal ni La Universidad de Almería asumen
responsabilidad alguna de los contenidos y opiniones de terceros sobre el
presente informe a partir de su posible difusión en redes sociales o medios de
comunicación, ni de las conclusiones que puedan extraerse del mismo que no
hayan sido explicitadas en el texto.

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VER ANEXO FOTOGRAFIAS DE LA MUESTRA

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28/06/2021

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Informe provisional (I)
ANEXO FOTOGRAFIAS
28 de Junio de 2021

Prof. Dr. Pablo Campra Madrid
Doctor en Ciencias Químicas y Licenciado en Ciencias Biológicas

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28/06/2021

ESCUELA SUPERIOR DE INGENIERIA
UNIVERSIDAD DE ALMERÍA, ESPAÑA

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MICROSCOPÍA OPTICA

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28/06/2021

8

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PATRON DE OXIDO DE GRAFENO REDUCIDO 10X
Antes del tratamiento

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9/30

28/06/2021

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PATRON DE OXIDO DE GRAFENO REDUCIDO 10X

Tratamiento: Exfoliación de escamas de rGO mediante 30s sonicación suave con pulsos de 5s mediante sonda

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28/06/2021

12

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28/06/2021

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28/06/2021

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oscuro)

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28/06/2021

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28/06/2021

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22/30

28/06/2021

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25/30

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Fecha

26/30

28/06/2021